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1樓 2011-08-25 12:44:41

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wanhscn

木蟲(chóng) (職業(yè)作家)

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西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 斑斑熱心哦！ 2011-09-20 18:08:45

水稻mtDNA

（1）線粒體的提取及純化
①剪苗勻漿：用剪刀沿距胚軸05-1cm處將黃化苗部分剪下，并剪碎成不長(zhǎng)于0.5cm的小碎段 (以下操作未經(jīng)注明，均在4℃進(jìn)行)，按5mL/g鮮重加入勻漿緩沖液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA；5mmol/L EDTA），用預(yù)冷的高速組織勻漿器搗碎3-5次，每次5-8s，四層紗布過(guò)濾，收集濾液。
②收集粗提線粒體：濾液經(jīng)2 000g離心15min后，收集上清，17 000g離心10min，收集沉淀，沉淀即為粗提線粒體。
③去核DNA：往此沉淀中加入0.1mL/g鮮重的酶解緩沖液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA），用毛筆輕輕懸浮沉淀，懸浮液再經(jīng)1 000g離心10min，取上清，加入DNaseI及MgCl2溶液，使兩者的終濃度分別為100μg/mL和10mmol/L，在4℃下反應(yīng)1h后，加入EDTA溶液至終濃度50mmol/L，終止DNase I的反應(yīng)。
④利用蔗糖襯墊法純化線粒體：將上述用DNase I處理過(guò)的線粒體懸液小心鋪在裝有Shelf緩沖液（0.6mol/L蔗糖；10mmol/L Tris-HCl，pH7.5；20mmol/L EDTA）的離心管中，Shelf緩沖液的用量為0.5mL/(g鮮重)。經(jīng)17 000g，離心15min后，棄上清，用0.1mL/(g鮮重)的勻漿緩沖液懸浮沉淀，再將此線粒體懸液小心鋪在裝有Shelf緩沖液的離心管中(Shelf緩沖液用量同上)，17 000g離心15min，所得沉淀即為純化的線粒體。
（2）線粒體DNA的提取
①去蛋白雜質(zhì)：在純化后的線粒體沉淀中加入裂解緩沖液（50mmol/LTris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA）0.1mL/(g鮮重)，混勻沉淀，再加入蛋白酶K和10%的SDS溶液，使兩者的最終濃度分別為100μg/mL和1%，充分混勻，37℃保溫2h以上，其間每隔10min振蕩1次。
②抽提、低溫沉淀：裂解液經(jīng)等體積酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次后，12 000g離心取上清，再加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的預(yù)冷異丙醇，-20℃沉淀0.5h以上。
③收集、洗滌、保存：12 000g離心10min，收集沉淀，70%乙醇洗滌1~2次，沉淀室溫涼干，溶于適當(dāng)體積的TE緩沖液或雙蒸水中，取5ml用于瓊脂糖檢測(cè)，余下于-20℃保存?zhèn)溆?br /> 這種提法，最后可用RNA酶處理一下，否者RNA較多，跑的膠不好看！
附件中式小麥mtDNA的提取！[ Last edited by wanhscn on 2011-9-20 at 11:28 ]

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真相是最大的奢侈品

8樓2011-09-20 11:24:12

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2樓2011-08-25 13:06:03

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只提取過(guò)動(dòng)物組織的線粒體

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3樓2011-08-30 11:18:36

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西瓜(金幣+1): 歡迎交流 2011-09-01 18:10:54

我們提取過(guò)棉花線粒體體的DNA, 用的是棉花的一周大小黃化幼苗，用的是上海杰美基因的試劑盒，缺點(diǎn)是提取量少，步驟較多！

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生物必成朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，甘做拓荒牛！

4樓2011-09-01 10:18:56

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tymayer

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3樓: Originally posted by 晴天1882 at 2011-08-30 11:18:36:
只提取過(guò)動(dòng)物組織的線粒體

請(qǐng)教一下，我用大鼠肝臟組織提取線粒體，雜質(zhì)很多，是什么原因？

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5樓2011-09-19 14:01:49

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5樓: Originally posted by tymayer at 2011-09-19 14:01:49:
請(qǐng)教一下，我用大鼠肝臟組織提取線粒體，雜質(zhì)很多，是什么原因？

你是用詹姆斯綠染色在顯微鏡下看到很多雜志嗎？這個(gè)原因我也不好說(shuō)�。≈型倦x心取沉淀和上清的次數(shù)有點(diǎn)多，離心時(shí)間和離心力應(yīng)該都會(huì)有影響的。

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6樓2011-09-20 09:17:18

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6樓: Originally posted by 晴天1882 at 2011-09-20 09:17:18:
你是用詹姆斯綠染色在顯微鏡下看到很多雜志嗎？這個(gè)原因我也不好說(shuō)��！中途離心取沉淀和上清的次數(shù)有點(diǎn)多，離心時(shí)間和離心力應(yīng)該都會(huì)有影響的。

我是用的mito-tracker green 染色在熒光顯微鏡下觀察的，老師說(shuō)這個(gè)染料的特異性值得懷疑，看起來(lái)一些雜質(zhì)膜片都被染色了。我用的是dounce勻漿器，覺(jué)得自己勻漿做的不太好，這個(gè)勻漿器你用過(guò)嗎？

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7樓2011-09-20 09:23:50

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3樓: Originally posted by 晴天1882 at 2011-08-30 11:18:36
只提取過(guò)動(dòng)物組織的線粒體

我想知道動(dòng)物組織的怎么提取，謝謝

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9樓2013-07-16 08:35:28

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2樓: Originally posted by Rain_loyer at 2011-08-25 13:06:03
我做的是藻類的線粒體分離提取，我的要求是高純的的線粒體，至少是沒(méi)有核的污染。如果前輩們有提取葉綠體線粒體DNA的方法（PS去除核DNA污染的），請(qǐng)介紹給我看看吧，3Q~

你好~我現(xiàn)在也要分離提取線粒體DNA，不知你之前完成得怎樣？可以分享些經(jīng)驗(yàn)么？

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10樓2015-03-05 18:44:54

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