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老夏853

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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10樓: Originally posted by tingspdf at 2011-09-01 21:54:39:
我們都是試劑盒提取，好一點(diǎn)的像MP-bio的Fast DNA spin kit for soil，要是資金不允許，用OMEGA的soil DNA Kit也可以，1500可以做50次，不是特別貴

上回跟一個(gè)老師交流說(shuō) 他們用試劑盒估計(jì)只能提到土壤中總DNA 的10% 左右吧我個(gè)人覺(jué)得做多樣性 DNA提取方法上還是要以能提到盡量多的DNA 為佳，不過(guò)則樣子提到的DNA 又很臟會(huì)影響后面的后續(xù)實(shí)驗(yàn) 著實(shí)是個(gè)瓶頸

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11樓2011-09-02 09:36:18

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lee.walker

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西瓜(金幣+1): Good 2011-09-02 11:05:21

用試劑盒提取，多做幾個(gè)平行重復(fù)！分別做PCR、純化回收，然后混合后進(jìn)行多樣性分析！

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12樓2011-09-02 10:33:26

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老夏853

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12樓: Originally posted by lee.walker at 2011-09-02 10:33:26:
用試劑盒提取，多做幾個(gè)平行重復(fù)！分別做PCR、純化回收，然后混合后進(jìn)行多樣性分析！

這樣也行不過(guò)這樣子由于平行混合引起的差異性應(yīng)該與樣品本身之間的差異性引起的多樣性可以相提并論了

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13樓2011-09-02 11:42:30

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cexoihtydx

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dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 歡迎多來(lái)交流，鼓勵(lì)啊 2011-09-03 15:33:30

1 土壤宏基因組提取，腐質(zhì)酸對(duì)后續(xù)PCR影響較大，沒(méi)有比較好的解決辦法。
2 我們組有中國(guó)70多個(gè)不同地理環(huán)境采集的土壤，土壤DNA做PCR時(shí)模板投入量常為20 ng每50 ul反應(yīng)體系。
3 引物的種類(lèi)不同，差異也很大。我們的經(jīng)驗(yàn)是: 根據(jù)基因氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物較好;其次是通過(guò)基因氨基酸序列比對(duì)后在保守區(qū)設(shè)計(jì)的低兼并度的兼并引物;效果最不好的就是非氨基酸保守區(qū)的特異性引物和氨基酸保守區(qū)的高兼并度的兼并引物!當(dāng)然因土壤基因多樣性差異很大，以上經(jīng)驗(yàn)不一定普遍適用。
4 引物濃度也需要摸索，特別是在使用兼并引物時(shí)，兼并度越大，引物的加入量也要相應(yīng)提高。
5 土壤基因組中含有目的基因的量有時(shí)很低很低，不同DNA聚合酶對(duì)模板的認(rèn)別能力也存在差異，往往擴(kuò)增效率低，目的條帶很淡，個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是rtaq對(duì)低濃度模板的識(shí)別能力最強(qiáng);但試驗(yàn)?zāi)康牟煌�，為避免基因因擴(kuò)增而產(chǎn)生堿基突變，常需要使用高保真聚合酶。
6 PCR時(shí)加入一些PCR添加劑，可起到積極的效果，如BSA， DMSO， TWeen20, NP40, DTT等。個(gè)人經(jīng)驗(yàn): PCR時(shí)加入2.5%的BSA效果較好，能提高PCR的擴(kuò)增效率!

[ Last edited by cexoihtydx on 2011-9-3 at 21:10 ]

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不放棄，日子總有陽(yáng)光，追求總有希望！

14樓2011-09-03 13:51:39

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老夏853

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14樓: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-03 13:51:39:
1 土壤宏基因組提取，腐質(zhì)酸對(duì)后續(xù)PCR影響較大，沒(méi)有比較好的解決辦法。
2 我們組有中國(guó)70多個(gè)不同地理環(huán)境采集的土壤，土壤DNA做PCR時(shí)模板投入量常為20 ng每50 ul反應(yīng)體系。
3 引物的種類(lèi)不同，差異也很大。我 ...

首先很感謝您的無(wú)私交流精神和耐心的打字以及負(fù)責(zé)任的再次編輯！！小木蟲(chóng)應(yīng)該就像這樣的回帖多一點(diǎn) 而不是日發(fā)帖量最多的是什么蟲(chóng)友互識(shí)什么云云~~

結(jié)合我一直的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，我感覺(jué)有以下幾點(diǎn)值得注意：
1 腐植酸的問(wèn)題。雖然不能完全去掉，我們可以想辦法減少，在提取DNA 的時(shí)候，一般手提的方法都會(huì)加入去腐植酸的緩沖液清洗步驟，在此，我個(gè)人經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，減少土壤的量以及加大緩沖液的體積以及增加一次洗滌，可以減少腐植酸的存留，不過(guò)這里應(yīng)該注意，12000轉(zhuǎn)離心時(shí)間不能太久，如果太久，洗過(guò)之后上清液顏色比較淺，個(gè)人感覺(jué)好像腐植酸還能離心下去一樣；另外，如果離心時(shí)間不夠菌體損失會(huì)對(duì)DNA 量以及多樣性造成影響，此處應(yīng)權(quán)衡；
2 引物的問(wèn)題：引物的加入量，我試過(guò)20uM 濃度的加0.25,0.4.0.5ul，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物一定量足以反應(yīng)，電泳照片泳道背景出現(xiàn)抹帶，應(yīng)該是底物沒(méi)有徹底反應(yīng)，并不是引物量不足，而關(guān)鍵模板可能存在什么東西抑制引物和模板的結(jié)合，而導(dǎo)致擴(kuò)增效率不高；
3 確實(shí)存在聚合酶適應(yīng)性問(wèn)題，感覺(jué)有的聚合酶就是適應(yīng)用來(lái)擴(kuò)增模板復(fù)雜的樣本，之前我們實(shí)驗(yàn)室一直用的是takara的 extaq 酶，按理說(shuō)價(jià)格和品質(zhì) 應(yīng)該是比較好的了，可就是一直擴(kuò)增不出來(lái)，后來(lái)我突發(fā)奇想換換mix 試試，我試過(guò)康為世紀(jì)的es taqmix ，效果挺好，雖然條帶不是很亮，很粗，但是亮度還是能接受的。在這里我申明我沒(méi)有詆毀寶生物也沒(méi)有給康為世紀(jì)做廣告，我只是就事論事，takara的酶可能品質(zhì)是好，不過(guò)不一定適應(yīng)復(fù)雜模板的擴(kuò)增，另外，這個(gè)康為世紀(jì)的mix內(nèi)可能添加什么保護(hù)劑。
最后，保護(hù)劑的問(wèn)題，二甲基亞砜我們實(shí)驗(yàn)室有師兄加過(guò)，bsa 我們現(xiàn)在還在加。一般文獻(xiàn)里面提到的都是1%的BSA，我也是按照1做的但是效果不好，偶然看到一篇說(shuō)是BSA 5%，我就試了試，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有效果，后來(lái)我做了1，2，3，4，5%的梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2%以后到5%，亮度逐漸增加，但是不明顯，不過(guò)用肉眼還是很明顯能看出4%和5%濃度的條帶亮度明顯比前面的要亮。

呵呵思維有點(diǎn)混亂，廢話有點(diǎn)多見(jiàn)諒各位！

[ Last edited by 老夏853 on 2011-9-4 at 09:13 ]

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15樓2011-09-03 22:54:38

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tingspdf

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引用回帖:

11樓: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-02 09:36:18:
上回跟一個(gè)老師交流說(shuō) 他們用試劑盒估計(jì)只能提到土壤中總DNA 的10% 左右吧我個(gè)人覺(jué)得做多樣性 DNA提取方法上還是要以能提到盡量多的DNA 為佳，不過(guò)則樣子提到的DNA 又很臟會(huì)影響后面的后續(xù)實(shí)驗(yàn) 著實(shí)是個(gè)瓶頸

那就做做加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)，看看能提出來(lái)多少

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16樓2011-09-04 15:22:00

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盡可能的將土壤中所有的微生物DNA提出來(lái)對(duì)于做多樣性來(lái)說(shuō)很重要，比如說(shuō)有的微生物壁特別難破，要是沒(méi)有破壁充分的話，其DNA很難釋放出來(lái)，所以破壁的方法很重要吧

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17樓2011-09-04 16:53:49

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16樓: Originally posted by tingspdf at 2011-09-04 15:22:00:
那就做做加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)，看看能提出來(lái)多少

這個(gè)方法的驗(yàn)證我不做跟我的方向主線有點(diǎn)遠(yuǎn)了

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18樓2011-09-04 18:21:00

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17樓: Originally posted by qiyi_love@ at 2011-09-04 16:53:49:
盡可能的將土壤中所有的微生物DNA提出來(lái)對(duì)于做多樣性來(lái)說(shuō)很重要，比如說(shuō)有的微生物壁特別難破，要是沒(méi)有破壁充分的話，其DNA很難釋放出來(lái)，所以破壁的方法很重要吧

很有道理。目前我們用但是是溶菌酶。但是我懷疑溶菌酶在這種復(fù)雜條件下的效率何如？聽(tīng)說(shuō)sigma 有一種細(xì)胞壁崩潰酶我去這個(gè)名字~~ 我用同學(xué)用來(lái)做霉菌感受態(tài)，據(jù)說(shuō)去壁效果不錯(cuò) 想用來(lái)試試

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19樓2011-09-04 18:22:48

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15樓: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-03 22:54:38:
首先很感謝您的無(wú)私交流精神和耐心的打字以及負(fù)責(zé)任的再次編輯！！小木蟲(chóng)應(yīng)該就像這樣的回帖多一點(diǎn) 而不是日發(fā)帖量最多的是什么蟲(chóng)友互識(shí)什么云云~~

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...

恩，共同學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步!

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20樓2011-09-05 19:45:17

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