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藥用植物麥冬ITS序列的擴(kuò)增？
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| 藥用植物麥冬ITS序列的擴(kuò)增，請(qǐng)高手指點(diǎn)一下，我擴(kuò)了一兩個(gè)月都沒能穩(wěn)定的擴(kuò)出來。ITS序列的擴(kuò)增引物分別為位于18S上ITS5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)和位于26S上的ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)。PCR反應(yīng)體系25μL總體積中，含有10×PCR buffer （上海生工）2.5μL；25mmol/L MgCl2 （上海生工）1.5μL；10 mmol/L dNTP mixture（上海生工） 0.5μL；10μmol/L引物各1.5μL；5 U/μL Taq DNA酶（上海生工）0.3μL；DNA模板3.0μL（約100ng）。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性50 sec，50℃退火50 sec，72℃延伸90 sec，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保溫。在那方面可能有問題呢？需做如何改進(jìn)。謝謝。。凝膠電泳圖見附件。 |
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jb1003(金幣+1):謝謝參與
dhd997(金幣+3): good 2011-08-31 17:06:25
jb1003(金幣+1):謝謝參與
dhd997(金幣+3): good 2011-08-31 17:06:25
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我做的PCR反應(yīng)體系是這樣的，你可以參考一下：50μL反應(yīng)體系 10×PCR Buffer 5μL Mgcl2 3μL dNTPs 4μL 10μmol/L引物 各0.5μL 5U/μL rTaq 0.5μL DNA模板 0.5μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性3min； 95℃變性1min； 55℃退火1min； 72℃延伸90s；30個(gè)循環(huán)； 72℃延伸8min，4℃保存。 根據(jù)你的反應(yīng)體系來看，可能是DNA模板濃度太高，適當(dāng)把模板濃度降低一點(diǎn)，我曾經(jīng)也是這樣，高濃度模板是P不出來的，后來稀釋了50倍，電泳檢測(cè)條帶是很亮的。你可以試試看。另外，循環(huán)次數(shù)過多非特性會(huì)增多的，退火溫度太低，非特異性也就多了。 |
2樓2011-08-31 14:33:38
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