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microz新蟲 (初入文壇)
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[求助]
重疊PCR克隆大片段
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因?yàn)榛蚪MGC含量很高，有一個(gè)3000bp的大片段怎么也擴(kuò)增不出來。 想分成兩段，采用重疊PCR試試。 問一下重疊部分最短20bp，最長能有多少？是否沒有限制？ 或者我分別克隆兩個(gè)片段，這兩個(gè)片段之間有幾百bp的重疊，是否依然能實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增？ [ Last edited by microz on 2011-9-1 at 20:45 ] |
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wanhscn
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4樓2011-09-05 21:09:53
microz
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3樓2011-09-05 21:02:42
瓶?jī)夯?/font>
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
wanhscn(金幣+3): ok 2011-09-05 21:19:13
wanhscn(金幣+3): ok 2011-09-05 21:19:13
| 可以重疊的，重疊一般可以到200bp左右，GC含量高的話就用TAKARA的LA Taq酶擴(kuò)就可以了。長的片段一般是采用分段擴(kuò)增的方式，再拼湊起來。一般每一段都做下TA克隆，克隆到T載體上效果比較好，直接PCR結(jié)果擴(kuò)的話可能會(huì)信號(hào)不大好。我是做鏈霉菌的，GC含量非常的高，就是用的TAKARA的LA Taq酶擴(kuò)增的，目的片段為2400bp，分三段來擴(kuò)，每一段約為1000bp，每次測(cè)序都正反方向測(cè)通，防止因測(cè)序信號(hào)不好而造成的堿基錯(cuò)誤。測(cè)序好了再用軟件拼接就可以得到完整的基因的序列了。 |
5樓2011-09-05 21:15:47
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