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shizishanshang至尊木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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[求助]
熒光定量問(wèn)題
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大家好，我現(xiàn)在在做熒光定量PCR，碰到一個(gè)問(wèn)題，請(qǐng)大家指教。 運(yùn)用簡(jiǎn)并引物的方法克隆到了某一基因的4個(gè)同源基因，同屬1個(gè)基因家族的。想做熒光定量PCR觀察其在不同時(shí)期，處理的表達(dá)。 現(xiàn)在問(wèn)題來(lái)了，4個(gè)都需要做嗎？其中兩個(gè)的同源性特別高，運(yùn)用primer3在線設(shè)計(jì)的引物在這兩個(gè)基因中都可以找到，這樣導(dǎo)致做熒光定量PCR時(shí)候觀測(cè)的值應(yīng)該是兩個(gè)基因 綜合，不能區(qū)分這兩個(gè)基因。 Score = 2235 bits (1210), Expect = 0.0 Identities = 1638/1838 (89%), Gaps = 56/1838 (3%) Strand=Plus/Plus 很多不同的地方都是在UTR，我是想通過(guò)跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物的，這樣就不用怕基因組污染了。一共有7個(gè)內(nèi)含子。 請(qǐng)大家指教。 謝謝！ |
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2樓2011-10-03 18:10:30
紅多多
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【答案】應(yīng)助回帖
shizishanshang(金幣+3): 謝謝！ 2011-10-04 15:11:23
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你好 可能是我沒(méi)明白你的意思，你說(shuō)是要看基因表達(dá)量的變化 那么你是不是應(yīng)該只考慮mRNA的序列就夠了？至于跨不跨內(nèi)含子貌似沒(méi)有什么區(qū)別，因?yàn)閮?nèi)含子往往在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中就開(kāi)始切除，到一個(gè)基因被轉(zhuǎn)錄出來(lái)的時(shí)候很可能已經(jīng)被切除了，那么這段序列貌似就沒(méi)辦法用來(lái)設(shè)計(jì)引物定量了。你說(shuō)的UTR區(qū)域是可以用來(lái)設(shè)計(jì)引物的，鄙人就這樣干過(guò)，只要這段序列存在于成熟mRNA上，理論上都可以用來(lái)設(shè)計(jì)引物，但需要注意的是不能太靠近mRNA的兩端，道理你懂的，容易降解。 我想如果要是我 我會(huì)這樣做，用擴(kuò)出來(lái)的基因首尾兩個(gè)外顯子（你是用DNA擴(kuò)出來(lái)的片段把）設(shè)計(jì)引物，在mRNA反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA中擴(kuò)增片段，將得到的序列測(cè)序，比對(duì)4個(gè)基因的測(cè)序結(jié)果，在非保守序列設(shè)計(jì)定量引物。 希望我的回答對(duì)你有幫助。 |
3樓2011-10-04 11:08:09
shizishanshang
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4樓2011-10-04 15:13:55
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5樓2011-10-04 15:19:02
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