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小丫的維尼熊木蟲 (小有名氣)
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報(bào)告基因 已有6人參與
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定義 報(bào)告基因 (reporter gene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。 特征 作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面必須具有以下幾個(gè)條件： (1)已被克隆和全序列已測(cè)定； (2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物； (3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。 應(yīng)用 在植物基因工程研究領(lǐng)域，已使用的報(bào)告基因有以下幾種：胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。nos、ocs這兩個(gè)基因是致瘤土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti質(zhì)粒特有的，對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，用相應(yīng)的致瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物體時(shí)，如果外源基因轉(zhuǎn)入植物體中，則這兩種報(bào)告基因在植物根莖葉中均能表達(dá)，不受發(fā)育調(diào)控，檢測(cè)時(shí)直接用轉(zhuǎn)化體提取液進(jìn)行紙電泳，染色后在紫外光下觀察熒光即可。nptⅡ、cat及慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因，均為抗生素篩選基因，相關(guān)的酶可以對(duì)底物進(jìn)行修飾(磷酸化、乙�；�)，從而使這些抗生素失去對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，使得含有這些抗性基因的轉(zhuǎn)化體能在含這些抗生素的篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，也可以用轉(zhuǎn)化體提取液體，外用同位素標(biāo)記，放射自顯影篩選轉(zhuǎn)化體。目前常用的一種報(bào)告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學(xué)檢測(cè)很穩(wěn)定，可用分光光譜、熒光等進(jìn)行檢測(cè)。熒光酶基因(luc)是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，該酶在有ATP、Mg2＋、O2和熒光素存在下發(fā)出熒光，這樣就可用轉(zhuǎn)基因植物整株或部分直接用X-光片或?qū)ｉT儀器進(jìn)行檢測(cè)。 在動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控的研究中，報(bào)告基因也被廣泛應(yīng)用。常用的有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氫葉酸還原酶基因、熒光酶基因等。cat基因作為報(bào)告基因，檢測(cè)時(shí)可通過放射自顯影觀察。熒光酶基因作為報(bào)告基因，具有檢測(cè)速度快、靈敏度比cat基因高30～1000倍、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的采用。 此外，在反式作用因子相互作用的檢測(cè)方式棗酵母雙雜交體系中，可通過報(bào)告基因的表達(dá)，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。雙雜交體系是由報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、報(bào)告基因及一對(duì)可以相互作用的雜合反式作用因子組成。近年來從上述雜交體系中發(fā)展出的單一雜交體系技術(shù)，也是根據(jù)報(bào)告基因表達(dá)量的檢測(cè)篩選出與已知順式作用元件相結(jié)合的未知因子的DNA，該項(xiàng)技術(shù)正廣泛應(yīng)用于克隆細(xì)胞中含量微弱且用生化手段難以純化的反式作用因子。 58gus報(bào)告基因 gus基因就是轉(zhuǎn)β-葡糖醛酸酶基因 該基因產(chǎn)物為GUS 蛋白質(zhì)，相當(dāng)穩(wěn)定而不易降解，并為一水解酵素，有簡(jiǎn)易的測(cè)定方法；且可使用市售的基質(zhì) (substrate) 在原位 (in situ) 顯現(xiàn)出酵素的活性，以肉眼即可檢測(cè)其產(chǎn)物，非常方便。 gus基因存在于E.coli等一些細(xì)菌基因組內(nèi)，編碼β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一個(gè)水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測(cè)出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測(cè)到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個(gè)基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。根據(jù)地gus基因檢測(cè)所用的底物不同，可以選擇三種檢測(cè)方法：組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法（靈感度為分光光度檢測(cè)法最高），其中最為常用的是組織化學(xué)法。 組織化學(xué)法檢測(cè)以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作為反應(yīng)底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細(xì)胞發(fā)生了解gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用于形成的靛藍(lán)染料，它使具Gus活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出Gus活性。因此利用該方法 可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。 GUS作為報(bào)告基因的優(yōu)缺點(diǎn) 采用報(bào)告基因是gus基因，它具有以下一些優(yōu)點(diǎn)： ①利用一個(gè)簡(jiǎn)單的組織化學(xué)檢測(cè)就可以精確地分析gus融合基因的時(shí)空表達(dá)模式。 ②GUS蛋白在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中穩(wěn)定存在，它對(duì)較高的溫度及去污劑有一定的耐受性。 ③檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，可以進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。以X-Gluc為底物，通過顯色反應(yīng)可直接觀察組織器官中g(shù)us基因的活性；以4-MUG為底物，GUS蛋白可以催化其水解為4-MU和β-D葡萄糖醛酸，4-MU分子中的羥基解離后被365nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455nm熒光，可用熒光分光光度計(jì)定量檢測(cè)。 ④在大多數(shù)植物組織中GUS活性的本底低； ⑤檢測(cè)時(shí)只需少量植物組織。 但是，在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)其存在一些不足： ① 染色不均勻。通常在傷口處較深。對(duì)材料進(jìn)行抽真空處理可以提高GUS染液的滲透能力，但是不能從根本上解決這一問題；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)需進(jìn)行染色的材料進(jìn)行徒手切片，再進(jìn)行染色會(huì)使染色效果得到改善。 ② 不能進(jìn)行活體染色。組織化學(xué)染色后愈傷失去繼續(xù)培養(yǎng)的可能，在檢測(cè)莖桿和葉鞘時(shí)會(huì)對(duì)材料造成很大的傷害及損失。 ③ 不能進(jìn)行亞細(xì)胞定位。如需要進(jìn)行亞細(xì)胞定位，可用gfp作為報(bào)告基因。 生物一一四，生物導(dǎo)航之家。 |
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3樓2011-10-06 21:06:46
terryxiaolei
木蟲 (正式寫手)
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4樓2011-10-08 14:19:00
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