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jack_1128管理員
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[求助]
血紅蛋白 四聚體 二聚體 高效液相和飛行時(shí)間質(zhì)譜
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大家好！ 想請(qǐng)教一下，我想看看我的血紅蛋白溶液中有沒(méi)有二聚體，正常血紅蛋白分子是以四聚體形式存在的，分子量為64000，可能會(huì)解聚成二聚體（分子量為32000），本來(lái)想跑電泳，但是一直是兩條帶都有，很奇怪 所以打算試試高效液相色譜或者飛行時(shí)間質(zhì)譜 想問(wèn)問(wèn)大家飛行時(shí)間質(zhì)譜會(huì)不會(huì)把血紅蛋白打碎啊？ 謝謝�。。� |
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寶雞鳳翔
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【答案】應(yīng)助回帖
jack_1128(金幣+10, 博學(xué)EPI+1): 非常感謝！��！ 2011-11-07 21:36:51
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下面是類似文獻(xiàn)的一部分，是可以用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的，你好好看看吧，不過(guò)這個(gè)蛋白質(zhì)選基質(zhì)不容易的，呵呵！ 3 結(jié)果與討論 3.1 兩種分析方法在蛋白質(zhì)定性和定量分析上的比較 iTRAQ標(biāo)記的多肽樣品用QStar XL MS/MS和MALDITOFTOF進(jìn)行了分析，通過(guò)比較獲得的蛋白質(zhì)定性和定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩者在定性和定量方面均存在顯著差異。QStar XL MS/MS共鑒定到置信度>95%的蛋白質(zhì)1481個(gè)，其中E2刺激前后差異在0.5倍以上的蛋白質(zhì)33個(gè)。MALDITOFTOF鑒定到置信度>95%的蛋白質(zhì)1719個(gè)，其中E2刺激前后差異在0.5倍以上的蛋白質(zhì)38個(gè)。對(duì)兩種儀器獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩種方法鑒定到的蛋白質(zhì)中有633種是相同的; 找到上調(diào)或下調(diào)0.5倍以上的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中有3種是相同的�？梢�(jiàn)，MALDITOFTOF無(wú)論是在定性上還是在定量方面均較QStar XL MS/MS找到蛋白質(zhì)多。文獻(xiàn)[9]也得出過(guò)相似結(jié)論。這可能與MALDI采用了離線的液相色譜分離方式，而QStar XL MS/MS采用在線的LCMS/MS串聯(lián)方式有關(guān)。MALDITOFTOF獲得的子離子系列不僅離子強(qiáng)度較高，而且較為完整。 比較兩種方法找到相同蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況(表1)可見(jiàn)，蛋白質(zhì)變化的方向是一致的，其中E2處理引起MCF7細(xì)胞中胰蛋白酶原C和1型胰蛋白酶的含量降低，引起細(xì)胞內(nèi)EIF4A1的含量顯著升高。其中用QStar XL獲得的兩種蛋白質(zhì)下調(diào)的幅度和EIF4A1上調(diào)的幅度較MALDITOFTOF檢測(cè)到的變化幅度大。對(duì)兩種不同類型儀器獲得的多肽串聯(lián)圖譜(圖1)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，用MALDITOFTOF分析獲得的子離子強(qiáng)度較用QStar XL獲得的子離子強(qiáng)度要高，得到的y離子序列較完整，這可能與MALDITOFTOF采用高能碰撞(High collision induced dissociation, HCD)以及檢測(cè)靈敏度較高有關(guān)。QStar XL得到的b離子序列較MALDITOFTOF完整。根據(jù)文獻(xiàn)[11，12]報(bào)道，這主要與碰撞誘導(dǎo)解離的方式有關(guān)。表1 用MALDITOFTOF 和QTOF找到的差異表達(dá)蛋白 3.2 兩種分析方法在多肽鑒定分析上的比較 比較兩種方法鑒定到置信度>95%的多肽發(fā)現(xiàn)，ESIMS/MS鑒定到1660種多肽，MALDITOFTOF鑒定到1169種多肽。其中1096種為ESIMS/MS獨(dú)有，605種為MALDITOFTOF獨(dú)有，564種為兩種方法共有。此結(jié)果與以往MALDITOFTOF 鑒定多肽的數(shù)目顯著高于QTOF的報(bào)道相反[9]。從結(jié)果可表2 用ESI QTOF和MALDITOFTOF鑒定到多肽的分子量比較 Peptide molecular weight (Mw)LowHighAverageMALDI0.042899.453789.071657.9ESI0.001399.218508.492028.2以看出兩種技術(shù)路線結(jié)合起來(lái)能夠顯著提高多肽鑒定的覆蓋率。通過(guò)比較兩者鑒定到多肽的質(zhì)量誤差(表2)可見(jiàn)，用ESIMS/MS得到多肽的質(zhì)量誤差(平均為0.001 Da)低于用MALDITOFTOF得到多肽的質(zhì)量誤差(平均為0.042 Da)。這與ESIMS/MS采用了全過(guò)程內(nèi)參自動(dòng)校正功能而MALDITOFTOF只在MS方式下進(jìn)行分析前的一次校正有關(guān)。ESIMS/MS得到多肽的分子量上限高于MALDITOFTOF的分子量上限，這與ESI的多價(jià)電荷產(chǎn)生功能有關(guān)，在本實(shí)驗(yàn)中，ESIMS/MS的檢測(cè)范圍設(shè)定在m/z 300～1680，而MALDITOFTOF設(shè)定為m/z 9004000，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[9]一致。 比較多肽的性質(zhì)(表3)可以發(fā)現(xiàn)，ESIMS/MS和MALDITOFTOF方法鑒定到多肽的C末端為R的多肽較K為多，兩者的K/R比率分別為0.83和0.85, 這與文獻(xiàn)[9]的結(jié)果不同。這可能是由于文獻(xiàn)[9]中分析的是大腸桿菌中的DNA結(jié)合蛋白(DNA結(jié)合蛋白大多為偏堿性的蛋白質(zhì))，而且多肽和蛋白質(zhì)的數(shù)目均顯著低于本研究所致。ESIMS/MS較MALDITOFTOF更易于疏水性多肽的離子化，這與文獻(xiàn)[9]的結(jié)果相同。本研究中ESIMS/MS鑒定到的多肽共由163330個(gè)氨基酸殘基組成，MALDITOFTOF方法鑒定到的多肽由82210個(gè)氨基酸殘基組成。對(duì)不同氨基酸殘基在總氨基酸數(shù)目中所占的比例進(jìn)行比較(圖2)發(fā)現(xiàn)，ESI傾向于離子化含疏水性氨基酸(A，F(xiàn)，G，I，L，P，V)較多的多肽，這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的結(jié)論一致;MALDI傾向于離子化含酸性氨基酸(D，E，N，Q)以及含羥基基團(tuán)(S，Y)的多肽，這一現(xiàn)象還未見(jiàn)報(bào)道。 圖2 不同氨基酸殘基在用MALDITOFTOF和QTOF鑒定到的多肽中的比例 4 結(jié) 論 在線LCESIMS/MS和離線的LCMALDIMS/MS是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中進(jìn)行高通量定性和定量分析時(shí)最常采用的兩種方法。本研究比較了LCESIQTOF(QSTAR XL)和LCMALDI/TOFTOF在蛋白鑒定和iTRAQ定量分析方面的性能。研究發(fā)現(xiàn)，MALDI有利于含酸性氨基酸和有羥基基團(tuán)的多肽的離子化，這有待用更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行證實(shí)。 在蛋白質(zhì)鑒定方面，盡管LCESIQTOF可鑒定到多肽的數(shù)目要明顯多于MALDI/TOFTOF，但通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定到蛋白質(zhì)的數(shù)目卻顯著低于MALDI/TOFTOF。兩種方法在蛋白質(zhì)鑒定和定量方面有很大的互補(bǔ)性，將兩種方法結(jié)合使用，將能夠顯著提高蛋白質(zhì)定性和定量的覆蓋率，分析出的交叉部分則有較高的置信度 http://www.studa.net/Clinical/110423/13253117-2.html |
2樓2011-11-06 21:18:23
pursuing
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3樓2012-01-10 16:49:19
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