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王玉民新蟲 (小有名氣)
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[求助]
急切求助感受態(tài)制備的問題，請高手指導(dǎo)
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這天制備的農(nóng)桿菌和大腸桿菌感受態(tài)都沒結(jié)果，郁悶死了，請高手指導(dǎo)，下面說我做的過程。 農(nóng)桿菌的制備與轉(zhuǎn)化： 菌株：EHA105 過程： 1.用挑取單菌落接種到含有50μg/ml利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)約17h。 3、將培養(yǎng)活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)到OD600約0.6。 4. 將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入滅過菌的50ml離心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2懸浮菌體。 6、于4℃，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2懸浮菌體。 7、每管200 μl分裝，液氮速凍，－70℃保存。 8. 加入4μl質(zhì)粒（約1μg）質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30 min。 3、置液氮中冰凍5min，迅速移入37℃水浴中溫浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液體YEB培養(yǎng)基，于28℃，,200rpm振蕩培養(yǎng)5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm離心2min，沉淀菌體，棄去上清。 5.用新的YEB培養(yǎng)基重新懸浮菌體后，均勻涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(載體抗性）固體培養(yǎng)基上，28度倒置培養(yǎng)24-48h。 大腸桿菌的制備與轉(zhuǎn)化 1.挑單菌落接種于4ml LB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振蕩培養(yǎng)過夜（約12小時(shí)左右）； 2. 取 1ml 過夜培養(yǎng)物按 1::50的稀釋比例轉(zhuǎn)接于50ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng) 4 小時(shí)，待細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期（OD600為 0.5~0.6）； 3. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的 50ml 無菌離心管中，置冰上 10 分鐘，使菌液冷卻到0℃。于 4℃、5000rpm 離心 10 分鐘，棄上清； 4.每只離心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l無菌 CaCl2將菌體重懸，冰浴放置 10 分鐘，于 4℃、5000rpm 離心 510分鐘，去上清； 5.每只離心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重懸沉淀。 6.液氮速凍 置-70℃保存?zhèn)溆谩?br /> 7.PUC19轉(zhuǎn)化無結(jié)果。 |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+2, MolEPI+1): 鼓勵(lì)積極應(yīng)助！ 2011-11-18 18:33:00
amisking(金幣+2, MolEPI+1): 鼓勵(lì)積極應(yīng)助！ 2011-11-18 18:33:00
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我只制備過大腸桿菌的感受態(tài)，樓主的步驟大的方向是這樣的，但是小細(xì)節(jié)方面不知道注意沒有： 1、樓主按1:50的比例稀釋，而且培養(yǎng)了4h，這個(gè)時(shí)間是不是有點(diǎn)長了；之前我的比例是1:100的比例，培養(yǎng)的時(shí)間為2.5-3h，而且搖好后可立即放到冰上 2、感受態(tài)的制備過程均是在冰上操作的，樓主只洗了1次，我一般洗2兩次，第一次10-15ml，第二次6ml，100mM的氯化鈣， 3、最后每管懸浮于1ml的氯化鈣中，分裝之前先將離心管預(yù)冷一下，再進(jìn)行分裝。 |
2樓2011-11-18 09:15:52
天使托
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3樓2011-11-18 10:27:04
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+3, MolEPI+1): Good!鼓勵(lì)分享!對樓主有幫助! 2011-11-19 18:44:24
wanhscn(金幣+3, MolEPI+1): Good!鼓勵(lì)分享!對樓主有幫助! 2011-11-19 18:44:24
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一般的做法，轉(zhuǎn)化后都會有個(gè)復(fù)蘇過程，農(nóng)桿菌這個(gè)可以加800uL YEB（無抗）培養(yǎng)基在1.5mL EP管里搖4-6個(gè)小時(shí)再涂板；大腸桿菌這個(gè)也可以復(fù)蘇45分鐘以后再涂板，可以一定程度提升轉(zhuǎn)化率。 此外，我們的大腸桿菌對數(shù)期標(biāo)準(zhǔn)為OD550或者600等于0.4，不要超過這個(gè)數(shù)值，不然氯化鈣法的轉(zhuǎn)化率降低很多。氯化鈣盡量使用含有結(jié)晶水的晶體新鮮配制，市售的無水氯化鈣往往不是很純。 收獲菌體的那一步，降溫要均勻迅速，我們一般在制冰機(jī)里搖震3角瓶。 |
4樓2011-11-19 16:32:39
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