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王玉民新蟲 (小有名氣)
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[求助]
急切求助感受態(tài)制備的問題，請(qǐng)高手指導(dǎo)
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急切求助感受態(tài)制備的問題，請(qǐng)高手指導(dǎo) 這天制備的農(nóng)桿菌和大腸桿菌感受態(tài)都沒結(jié)果，郁悶死了，請(qǐng)高手指導(dǎo)，下面說我做的過程。 農(nóng)桿菌的制備與轉(zhuǎn)化： 菌株：EHA105 過程： 1.用挑取單菌落接種到含有50μg/ml利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)約17h。 3、將培養(yǎng)活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)到OD600約0.6。 4. 將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入滅過菌的50ml離心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2懸浮菌體。 6、于4℃，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2懸浮菌體。 7、每管200 μl分裝，液氮速凍，－70℃保存。 8. 加入4μl質(zhì)粒（約1μg）質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30 min。 3、置液氮中冰凍5min，迅速移入37℃水浴中溫浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液體YEB培養(yǎng)基，于28℃，,200rpm振蕩培養(yǎng)5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm離心2min，沉淀菌體，棄去上清。 5.用新的YEB培養(yǎng)基重新懸浮菌體后，均勻涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(載體抗性）固體培養(yǎng)基上，28度倒置培養(yǎng)24-48h。 大腸桿菌的制備與轉(zhuǎn)化 1.挑單菌落接種于4ml LB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振蕩培養(yǎng)過夜（約12小時(shí)左右）； 2. 取 1ml 過夜培養(yǎng)物按 1::50的稀釋比例轉(zhuǎn)接于50ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng) 4 小時(shí)，待細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600為 0.5~0.6）； 3. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的 50ml 無(wú)菌離心管中，置冰上 10 分鐘，使菌液冷卻到0℃。于 4℃、5000rpm 離心 10 分鐘，棄上清； 4.每只離心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l無(wú)菌 CaCl2將菌體重懸，冰浴放置 10 分鐘，于 4℃、5000rpm 離心 510分鐘，去上清； 5.每只離心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重懸沉淀。 6.液氮速凍 置-70℃保存?zhèn)溆谩?br /> 7.PUC19轉(zhuǎn)化無(wú)結(jié)果。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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rainwander: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2012-06-07 08:51:31
rainwander: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2012-06-07 08:51:31
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大腸桿菌的感受態(tài)應(yīng)該是很容易做的，結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)操作說說我自己的經(jīng)驗(yàn)吧： 1、集菌的離心時(shí)間5000rpm 5min就夠 2、轉(zhuǎn)接之后的培養(yǎng)時(shí)間有些長(zhǎng)，如果按照1:50的比例接，我一般培養(yǎng)2~3h就開始做感受態(tài)，感受態(tài)效果與菌的活力成正相關(guān)，不見得菌越多越好 3、CaCl2作用一次不如兩次效果好，第二次重懸之后冰上孵育的時(shí)間可以盡量延長(zhǎng)，幾個(gè)小時(shí)都沒有問題， 4、集菌之后的左右操作一定要保證在冰上，盡量縮短將菌體暴露于常溫下 5、最后一步CaCl2重懸后，應(yīng)該添加15~20%的甘油作為保護(hù)劑，然后分裝保存于-80℃冰箱即可。50ml的菌，最后用5ml重懸都可以的。 |
5樓2012-06-07 07:02:42
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