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zhang8826857

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http://www.genome.wisc.edu/resou ... utationprotocol.htm

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1樓 2011-12-06 09:30:29

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zhouxiaohan

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好的。幫你存了。

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2樓2011-12-06 09:42:54

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hs2451

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呃 chrome打開有很多問(wèn)號(hào) IE打開就是由很多方框了不過(guò)我感覺(jué)不太影響使用啊樓主看到的是神馬樣子？

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中國(guó)是不朽的

3樓2011-12-06 09:43:22

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mlanqiang

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呵呵呵，木有問(wèn)題。

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藍(lán)精靈

4樓2011-12-06 09:54:26

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引用回帖:

4樓: Originally posted by mlanqiang at 2011-12-06 09:54:26:
呵呵呵，木有問(wèn)題。

那給額上傳上來(lái)啊，東西呢？呵呵

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好孩子！

5樓2011-12-06 10:59:29

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3樓: Originally posted by hs2451 at 2011-12-06 09:43:22:
呃 chrome打開有很多問(wèn)號(hào) IE打開就是由很多方框了不過(guò)我感覺(jué)不太影響使用啊樓主看到的是神馬樣子？

那給額上傳上來(lái)啊，東西呢？呵呵

額看到也是很多問(wèn)號(hào)。。。

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6樓2011-12-06 10:59:51

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2樓: Originally posted by zhouxiaohan at 2011-12-06 09:42:54:
好的。幫你存了。

那給額上傳上來(lái)啊，東西呢？呵呵

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7樓2011-12-06 11:00:02

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西瓜

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zhang8826857(金幣+15): ^_^^_^^_^ 2011-12-06 11:29:19
zhang8826857: 回帖置頂 2011-12-06 11:42:58

Transposon-mediated Mutagenesis

Step 1 - Amplify ORF from MG1655

1.0 ul          genomic DNA (30ng/ul)
5.0 ul          gene specific primer mix
4.0 ul          2.5 mM dNTP
5.0 ul          10x Turbo Pfu buffer
0.7 ul          Turbo Pfu
34.3 ul          sterile distilled H2O
50 ul

95°C                95°C             55°C             72°C             72°C                4°C
1min                15sec             15sec             4min                5min                forever
                                          25 cycles

Step 2 - Transposition reaction

  6 ul    ORF PCR product (~100-200ng)
  2 ul    Tn (Transposon, 200ng = 0.2pM)
  1 ul    10x Tn reaction buffer (Epicentre)
  1 ul    Tnase (Transposase; Epicentre)
10 ul

Vortex, spin down
37°C for 2hr
Add 1 ul stop solution, 10min 70°C
Purify by passing through G50 column

Step 3 – Transformation

MG1655 cells harboring the pKD46 plasmid (Datsenko and Wanner, 2000, PNAS  97(12):6640-5) are induced with arabinose to activate expression of the lRed genes and prepared for electroporation.

1. Mix following on ice:

         4.4 ul transposition reaction
         40 ul MG1655 w/pKD46 electrocompetent cells

2. Transfer entire volume (~45ul) to chilled cubette (0.1cm gap), kept on ice

3. Electroporate with the following settings (for BioRad Pulse Controller)

Low Range 200
High Range 500
Capacitance (uF): -25
Total Volts: 1.8kV

4. Resuspend cells with 1ml LB and transfer contents to a 48-well growth block

5. Outgrow at 37°C for 1hr

6.  Spread entire outgrowth on a corresponding labeled LB + Amp(100ug/ml)/Kan (50ug/ml) plate in a hood and air dry.

7. Grow at 300 (to maintain pKD46). (1- 2 days)

Step 4- Picking

Day 1

1. Streak 2 colonies to single colonies on LB + Amp(100ug/ml)/Kan (50ug/ml) plates. These will be the first colonies to verify.

2. Pick 3 additional colonies into separate 96-well flat bottom plates containing 200ul Freezing media + Amp(100ug/ml)/Kan(50ug/ml) maintaining original well location.

3. Grow 300 overnight.

Day 2:

1. Grow 1 colony from each streak plate in a 96-well block with each well containing 1ml Freezing media + Amp(100mg/ml)/Kan(50mg/ml). Grow 300 overnight.

2. Freeze overnights of the other 3 plates.

Step 5– Verify mutation by Culture PCR

1. Prepare sample

Mix culture thoroughly.
Transfer 20ul of culture into a 96-well plate and dilute with 80ul H2O Mix thoroughly

2. PCR Reaction.

   5 ul                      diluted culture
   4 ul                      gene specific primer mix (same as in Step 1)
  2.5 ul                      ExTaq premix
16 ul                      H2O
50 ul

95°C                94°C          55°C                72°C             72°C                4°C
5min                30sec          15 sec             4min                5min                forever
                                       30cycles

3. Run 7 ul on 1 % test gel in 0.5x TAE to check.

4. Analyze gel results; mutants will be ~1.2kb larger than original gene length.

Step 6 - Confirm mutations by sequencing

1. EXOSAP clean up

- Transfer 10ul of PCR product for all genes with mutant sized fragments into a separate PCR plate
- Add 4ul ExoSAP-IT (USB) to each reaction
- Spin briefly
- React @ 37°C for 30min, then 15min@ 80°C

2. Sequence

1. Add a mix of the following to each ExoSAP reaction:

1ul of primer (KAN-2 FP-1 @ 10uM -Epicentre)
2ul Big Dye dilution Buffer (Promega)
3ul Big Dye

2. Reaction conditions: (10sec@96C; 5sec@50C; 4min@60C) for 25cycles.

3. Purify through a G50 column

4. Dry plate and run on sequencer

3. Make tube stocks of confirmed mutants

Step 7 - Curing the temperature sensitive pKD46 plasmid

1. Streak confirmed mutants on a LB + Kan plate (from the above stock). Grow at 43° overnight (non-permissive temperature for pKD46 replication).

2. With a single colony inoculate the following:

1. Growth block well containing 1ml Freezing media + Kan(50ug/ml)/well .
2. LB+Kan agar in a 96 well plate
3. LB+Amp agar in a second 96-well plate

3. Grow overnight at 37°C. Cured cells will grow on Kan but not on Amp.

4. Confirm by PCR and sequencing as above.

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8樓2011-12-06 11:14:51

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zhang8826857(金幣+5): 你太有才啦啦啦啦啦啦啦，呵呵，好了，多謝啦 2011-12-06 11:32:51
zhang8826857: 回帖置頂 2011-12-06 11:42:55

我用Chrome和IE都是亂碼。
IE內(nèi)核的瀏覽器的話，右鍵點(diǎn)擊空白處，然后依次選擇：
編碼》其他》西歐（Windows）
搞定

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9樓2011-12-06 11:17:29

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1949stone: 神奇的西瓜 2011-12-06 11:36:15

好吧我無(wú)聊，Chrome的也弄好了：
菜單欄里面的“設(shè)置”，或者點(diǎn)那個(gè)扳手的圖標(biāo)，依次選擇：
工具》編碼》西歐語(yǔ)言（Windows-1252）

主要是那個(gè)網(wǎng)頁(yè)用了一些不常用的符號(hào)，常用的“簡(jiǎn)體中文”或者“Unicode”這兩種編碼方式里面沒(méi)有這些東東。

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10樓2011-12-06 11:26:12

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