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【轉(zhuǎn)載】研究基因功能的“七大絕招”與“三板斧”--唐凌峰 已有26人參與
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轉(zhuǎn)自科學(xué)網(wǎng)唐凌峰的博客 . 尊重原著，該粗體的地方也加粗了 研究基因功能的“七大絕招”與“三板斧” 唐凌峰 2011.12.6-12.8 生命科學(xué)的研究有很大一部分集中于研究基因及其產(chǎn)物的功能。到底有哪些方法可以用來研究基因功能呢？本文初步總結(jié)為“七大絕招”和“三板斧”。掌握了這“七大絕招”和“三板斧”，設(shè)計實驗更容易，看文獻聽學(xué)術(shù)報告也更輕松。 第一招： 天地人合 無論是學(xué)習(xí)還是研究，必須遵循的一個原則是“從生活中來，到生活中去”。學(xué)習(xí)的時候，如果與日常生活中熟悉的、簡單的事情結(jié)合起來理解，就可以化繁為簡，化難為易。學(xué)習(xí)的目的是為了應(yīng)用，學(xué)到的東西，必須應(yīng)用到日常生活中去。 怎樣研究基因的功能？要回答這個問題，我們先看怎樣研究人的功能。假如你是男生，喜歡上了一個“女生”，可是這個“女生”長得撲朔迷離，帥氣中帶著嫵媚，羞澀中透出豪爽。所以，你面臨的第一個問題就是：TA到底是男還是女？第二個問題是：TA是不是學(xué)生？如果是的話，是本校的嗎？你不認識TA的任何朋友，所以也沒法打聽。為了回答這幾個問題，你決定翹課跟蹤TA。你發(fā)現(xiàn)，白天的大多數(shù)時間，TA去了本校教學(xué)樓的教室。你守在教室的洗手間旁邊，觀察TA下課的時候上洗手間，去的是男洗手間還是女洗手間。高興的是，你發(fā)現(xiàn)TA去了女洗手間（終于松了一口氣）。不過你比較小心，為防萬一，你又跟蹤她，看她晚上回宿舍去的是男生宿舍還是女生宿舍。不出所料，她去了本校的女生宿舍。這下你終于放心了：她是本校的一個女生。 因為她去女洗手間和女生宿舍，提示她是女的。因為她白天去本校教室，晚上去本校女生宿舍，提示她是本校女生。上述事例告訴我們：一個人什么時候，在哪里活動可以提示其身份。同樣，基因表達的時間和部位，常�？梢蕴崾酒涔δ� 。例如，如果基因A在胚胎發(fā)育過程中表達，成年后不表達，則提示該基因與發(fā)育有關(guān)。基因B在在大腦的海馬中表達，而海馬與記憶有關(guān)，那么這個基因可能與記憶有關(guān)。 接下來的問題就是：她是哪個系的？她有什么興趣愛好？你發(fā)現(xiàn)，她有兩個個形影不離的好朋友。你恰好有同學(xué)認識她的這兩個朋友。同學(xué)告訴你：她兩個好朋友都是中文系的，都喜歡打羽毛球。這時，你基本上就可以認為這個女生是中文系的，愛好之一是羽毛球了。 以上所述可以歸納為三點：天時，地利，人和。“天時”指基因及其產(chǎn)物什么時候表達，“地利”指的是基因及其產(chǎn)物表達于哪個部位�！叭撕汀笨梢赃M一步引申為兩點：1. 近朱者赤，近墨者黑。就是說一個人會與他經(jīng)常接近的人相似�；蛞彩侨绱�，相互作用的一些基因常常具有類似的功能，它們?yōu)榱送瓿赏粋�功能而通力合作。例如，如果實驗發(fā)現(xiàn)蛋白C與蛋白D相互結(jié)合，而基因D是某一信號通路的受體，則基因C可能也是該信號通路的成員。2. 近豬者吃，近墨者喝。就是說一個人不僅會經(jīng)常接觸與自己類似的人，還經(jīng)常接觸自己的工作對象。例如，一個經(jīng)常與學(xué)生接觸的人，既可能是學(xué)生（近朱者赤），也可能是老師（近豬者吃）。同理，與一個基因接觸的其它基因或者物質(zhì)，也可能是其作用的對象。例如，如果蛋白質(zhì)F與DNA結(jié)合在一起，則提示其對DNA發(fā)揮作用，可能參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等。 “合”指的是合理。億萬年的進化使不合理的基因基本上都被淘汰了，所以存在的基因其功能必定是合理的，至少具有合理性的一面。合理的表現(xiàn)就是能夠促進個體的生存和繁衍。合理遵循兩個原則：一，經(jīng)濟原則。生物不會浪費物質(zhì)和能量在一個無用或者冗余的基因上。凡是一個基因可以實現(xiàn)的功能，沒有必要用兩個基因。二，有效原則�；虻墓δ軕�(yīng)該促進而不是損害生物的生存和繁衍。根據(jù)合理性原則，無需任何實驗證據(jù)，我們不難想到非編碼DNA序列是有用的，不是無用的垃圾。 第二招：患得患失 有人說，金錢不是萬能的，但是沒有金錢是萬萬不能的。那么，金錢到底有什么作用呢？有兩種方法可以知道答案。第一種方法是你去一個陌生的地方，突然錢包被偷，所有的現(xiàn)金、信用卡和可以換錢用的物品都沒有了。此時，你就知道錢的作用是什么了。第二種情況是你買彩票突然中了一千萬，很快，你也可以知道錢的作用是什么。得到和失去，都可以讓我們知道事物和人物的功能，而其中失去更為有效。 得，指的是基因的過表達（Overexpression）；失，指的是基因敲除（Knockout）或者低表達（Under-expression）。例如研究的假說是基因A與記憶力呈正相關(guān)，那么可以這樣設(shè)計實驗：先過表達基因A，預(yù)期結(jié)果是記憶力增強，再降低基因A的表達水平，或者完全敲除（如果不是lethal的話），預(yù)期結(jié)果是記憶力減弱。一個高質(zhì)量的實驗設(shè)計，一般應(yīng)該“患得患失”，兩方面的實驗都要做。 我們不僅要“患得患失”，還要“斤斤計較”。因為過表達或低表達的水平不同，表型改變可能也不同，甚至看不到表型改變。例如，用RNAi Knockdown一個基因的表達水平的70%也許看不到任何變化，但是Knockdown 90%就能觀察到表型改變了。所以，當(dāng)過表達或者低表達研究基因卻沒有得到預(yù)期結(jié)果的時候，就需要考慮基因表達水平的變化是否不足。 有時即使完全敲除一個基因也看不到任何表型的改變，此時也不能下“研究基因與研究表型無關(guān)”的結(jié)論。這就好比一個橋有十個橋墩，如果只去除掉橋墩4，在非過負荷的情況下，橋可能不會倒塌，可以正常通車�？墒�，如果先去除掉橋墩5，再去除橋墩4，橋就會倒塌了。我們能夠認為橋墩4是無用的嗎？當(dāng)然不能。橋墩在這里好比處于同一個通路具有相似功能的基因，橋是否可以通車好比基因的表型是否正常。所以，在敲除一個基因A看不到表型改變的情況下，可以在基因B（與A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的動物模型上敲除基因A，觀察敲除后是否有變化。 有時候，全身性的過表達、低表達或者基因敲除會出現(xiàn)我們不想要的結(jié)果。例如，全身性的基因敲除會致命。為了解決這個問題，現(xiàn)已開發(fā)出許多種組織特異性和時間特異性的過表達、低表達和基因敲除技術(shù)，使得基因調(diào)控更加準確。 第三招：上下求索 基因需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄為RNA、翻譯為蛋白質(zhì)至少兩步才能發(fā)揮功能。所以，研究一個基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)的水平分別進行研究。DNA的水平相同，不代表RNA的水平相同；同樣，RNA的水平相同，不代表在蛋白質(zhì)的水平相同。哪怕就是在RNA水平，還有不同的剪切的可能。 一個基因翻譯成蛋白質(zhì)之后，常常需要同其它的基因及其產(chǎn)物相互作用才能發(fā)揮功能。例如基因S，翻譯成蛋白質(zhì)S，如果它是配體，就需要和受體結(jié)合，然后受體激活信號通路。如果S鑒定出來了而其余的通路基因沒有鑒定出來，那就可以研究上游的配體和下游的信號通路基因分別是什么。一個轉(zhuǎn)錄因子，常常可以激活或抑制一系列基因的表達，究竟可以控制哪些下游基因，也值得研究。蛋白質(zhì)發(fā)揮功能，常常會有正性調(diào)控和負性調(diào)控因子。從上游來看，哪些基因及其產(chǎn)物可以促進或抑制研究基因的表達水平？具體機制是怎樣的？從下游來看，哪些基因及其產(chǎn)物可以增強或者減弱研究基因的功能？具體機制是怎樣的？這些都可以研究。 所以，研究一個基因，就可以在不同的表達水平和不同的作用水平上“上下求索”。 第四招：背井離鄉(xiāng) 背井離鄉(xiāng)，指的是misexpression，就是在非正常時間、非正常位置、非正常物種（時間、地點、人物）表達一個基因。如果在正常情況下，研究基因具有特定功能，而且在非正常時間、非正常位置和非正常物種間表達的時候同樣導(dǎo)致該功能，則我們下“該基因具有該特定功能”的結(jié)論就更有把握。 值得注意的是，misexpression不產(chǎn)生預(yù)期表型，并不能認為研究基因與該表型無關(guān)。因為一個基因發(fā)揮作用，需要很多其它基因的幫助。如果misexpression的部位、時間、物種缺乏該基因發(fā)揮功能需要的輔助基因，或者多了可以抑制該基因功能的其它基因的表達，則可以導(dǎo)致預(yù)期表型無法產(chǎn)生。如果misexpression產(chǎn)生了某一表型，不代表該表型是該基因的正常功能，原因同上。所以，misexpression告訴我們：該基因“可以”做什么，不代表該基因?qū)嶋H上做了什么。打個比方，我們把一個教授放到農(nóng)村去，他沒法接觸到做科研需要的設(shè)備、文獻等，而且迫于生計，他不得不自己種田維持生存。我們能夠下結(jié)論說：教授的社會職能是種田嗎？當(dāng)然不可以。但是我們可以說：教授是“可以”種田的。 第五招：內(nèi)外兼修 體外實驗（In vitro）簡單便捷，可以很快得到結(jié)果�？墒牵w外實驗的條件和體內(nèi)的情況不一樣，體外實驗得到的結(jié)果一般還需要體內(nèi)實驗（In vivo）來驗證�！皟�(nèi)外兼修”指的是既做體外實驗， 又做體內(nèi)實驗。這一招不是太常見，有些文章不一定同時做體內(nèi)和體外實驗。 第六招：十面埋伏 當(dāng)你論證一個觀點的時候，可能會有人反駁你。一篇好的文章，必須提前想到這些反駁，并通過做相應(yīng)實驗設(shè)下“埋伏”，反駁這些可能的反駁；此外，還應(yīng)通過類似實驗重復(fù)驗證來增加結(jié)論的可靠性，這就叫做“十面埋伏”。 中醫(yī)診治病人，需要“望聞問切”，把四種方法得到的信息綜合起來才能做出正確的診斷，這叫“四診合參”。（題外話：電視劇里僅僅通過望診或者僅僅把脈就開藥的中醫(yī)，基本上都是騙人的。實際生活中遇到這樣的中醫(yī)，可以判斷為江湖游醫(yī)。）歷史學(xué)上有一個說法叫做“孤證不立”，就是說如果只有一條證據(jù)支持一個論點，那么這個論點是不可靠的。生活中，如果有一個人說某人有問題，他不一定真的有問題。可是如果很多人都說他有問題，那他就很可能真的有問題了。 如果僅僅從一篇文章的角度來考慮，做這么多的實驗不是很有必要。例如，做了第一個實驗，結(jié)論成立的可能性是80%，做了第二個，可能性上升到95%。可是，科研是積累性的，你的結(jié)論是別人推理的基礎(chǔ)，你推理的基礎(chǔ)則是前人的結(jié)論。假如A1引用了你的文章，A2又引用了A1的文章，如此反復(fù)一直到A10。如果每篇文章結(jié)論正確的概率是80%，則A10文章結(jié)論正確的概率是0.8010=10%，如果每篇文章結(jié)論正確的概率是95%，則A10文章結(jié)論正確的概率是0.9510=60%。差別從一開始的15%，變成6倍了。所以，多做實驗增加結(jié)論的可靠性，對于科學(xué)的長期發(fā)展是至關(guān)重要的。 看文獻的時候，你會發(fā)現(xiàn)作者做了一大堆實驗，這么多的實驗就像唐僧在你耳邊念經(jīng)一樣，把你弄得暈頭轉(zhuǎn)向。為了提高看文獻的效率，一般只看關(guān)鍵實驗，次要的實驗可以略過。當(dāng)你做學(xué)術(shù)報告時，由于時間有限，只報告關(guān)鍵實驗。等到觀眾提問時，這些次要實驗就可以派上用場了。例如，聽完你的報告，有聽眾提問說：“我覺得你的結(jié)果還有兩種可能的解釋，包括。。。你怎樣得出這個結(jié)論的呢？”此時，你就可以從容自若的說：“這是一個很好的問題。針對第一種可能，我們做了XX實驗，結(jié)論不支持這個可能。針對第二種可能，我們做了XX實驗，發(fā)現(xiàn)。。�！� 看到了吧？這就是“十面埋伏”的妙處。 第七招：一網(wǎng)打盡 如上所述，每一個基因都有作用于它的上游基因，也有受它作用的下游基因。每一個上游基因和下游基因又分別有自己的上下游基因。除了上下游基因及其產(chǎn)物，細胞內(nèi)、機體內(nèi)的其它物質(zhì)例如離子等也都會作用于基因自身。用馬哲的觀點來說就是聯(lián)系無處不在，無時不有。這些聯(lián)系構(gòu)成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。目前生命科學(xué)的一個發(fā)展趨勢就是研究基因網(wǎng)絡(luò)。所以，研究一個基因的功能，還可以構(gòu)建出它所處的網(wǎng)絡(luò)。 科研中的例子： 為了說明上述方法的應(yīng)用，我們可以看一篇發(fā)表于PNAS 2011年5月的文獻。文章鏈接：http://www.pnas.org/content/108/19/8059.short 本文思路簡單，用到上述“七大絕招”中的三招：天地人和：作者首先通過原位雜交和免疫染色發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路表達于果蠅的大腦中的蘑菇體。因為蘑菇體是果蠅嗅覺記憶中樞，所以作者推測JAK/STAT信號通路與果蠅的記憶有關(guān)�；嫉没际В喝缓笸ㄟ^不同的手段抑制JAK/STAT信號通路的活性，發(fā)現(xiàn)果蠅長期記憶受損。最后，作者得出結(jié)論：JAK/STAT信號通路是果蠅長期記憶形成所必須的。十面埋伏：在每一個階段，作者都做了大量的實驗來支持一個觀點。例如為了說明JAK/STAT信號通路在蘑菇體有活性，作者首先用原位雜交的方法檢測了該信號通路的總共5個基因中的4個；然后又用免疫染色的方法檢測了5個基因中的3個，最后還用一種叫做enhance trap的方法檢測了5個基因中的1個。一個8個實驗，個個都表明JAK/STAT信號通路表達于果蠅蘑菇體（真夠煩人的要不是為了寫這篇博文，我都懶得看）） 生活中的例子： 一切道理都是相通的。本文所說的方法不僅適用于研究基因功能，還適用于研究其它物質(zhì)和事物的功能，例如激素、藥物、療法等。除了適用于科研，還適用于日常生活。舉例來說，假如我們想知道黑社會對社會有什么影響，就可以：天地人和：調(diào)查黑社會活動的時間和地點，經(jīng)常接觸的人物�；嫉没际В虹P除黑社會，看社會有何變化；增加黑社會的規(guī)模，看社會又有什么變化。上下求索：看看上面有哪些人是黑社會的保護傘，下面有哪些人是黑社會的衣食父母和后備軍。背井離鄉(xiāng)：把黑社會從我國趕到鄰近國家，看對他們有何影響。十面埋伏：必須多方查證，例如敲詐勒索一起還不夠，要敲詐勒索幾百起，行賄受賄數(shù)十人，黃賭毒一應(yīng)俱全，橫行鄉(xiāng)里，無惡不作，才可以充分證明黑社會的危害性。一網(wǎng)打盡：從政治、經(jīng)濟、文化、教育等社會各方面看黑社會與其有何聯(lián)系。 三板斧：天時地利，患得患失，十面埋伏 為了增加適用范圍，上面一共總結(jié)出了七大絕招，但卻不夠簡練。一個研究或者一篇文章，常常只用到其中的一部分。為了更加簡潔，可以總結(jié)為最重要的“三板斧”：天時地利，患得患失，十面埋伏。“天時地利”，指的是基因何時何地表達�！盎嫉没际А�，其中“患失”比“患得”重要得多�！笆媛穹�，指的是立體論證�；旧�，每一個研究都離不開這三板斧，上述文章就是一個很好的例子。而只要學(xué)會這三板斧，就可以做大部分科研了。所以，科研就是這么簡單！ （說明：本文是對大約一年前的博文《研究基因功能的“四大絕招”（初步總結(jié)版）》的修改和補充。本文仍存在繼續(xù)修改的可能） [ Last edited by 西瓜 on 2011-12-9 at 22:44 ] |
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