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fangfang0044木蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于蛋白酶活性測定的問題，求解~
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| 最近再做一個有關(guān)胰酶的活性測定的實驗，看文獻有用到蛋白底物N-succinyl-l-ala-l-ala-l-pro-l-phe-p-nitroanilide (AAPF-NA)（中文名：N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸-4-硝基苯胺）作為活性測定的底物。但沒有具體的有關(guān)標區(qū)的建立及測定的方法，求高手指點~ |
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中華人民共和國專業(yè)標準 蛋 白 酶 活 力 測 定 法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本方法適用于釀造醬油時在制品菌種、成曲的蛋白酶活力測定。 1 福林法 1.1 試劑及溶液: 以下試劑都為分析純 1.1.1 福林試劑(Folin試劑):于2000mL磨口回流裝置內(nèi),加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O) 100g,鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸餾水700mL,85%磷酸50mL,濃鹽酸100mL,文火回流10h。 取去冷凝器,加入硫酸鋰(Li2SO4)50g,蒸餾水50mL,混勻,加入幾滴液體溴,再煮沸15min, 以驅(qū)逐殘溴及除去顏色,溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色,需要再加幾滴溴液,再 煮沸除去之。冷卻后,定容至1000mL,用細菌漏斗(No4～5)過濾,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。 1.1.2 0.4mol碳酸鈉溶液: 稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 稱取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即 成0.2mol溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成 0.2mol溶液(B液)。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸餾水稀釋1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸鹽緩沖液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:準確稱取干酪素2g,稱準至0.002g,加入0.1N氫氧化鈉10mL,在 水浴中加熱使溶解(必要時用小火加熱煮沸),然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL即 成。配制后應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存,否則極易繁殖細菌,引起變質(zhì)。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精確稱取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N鹽酸使溶解,用0.2N鹽酸定容至100mL,其濃度為1000μg/mL,再吸取此液10 mL,以0.2N鹽酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也應(yīng)及時使 用或放入冰箱內(nèi)保存,以免繁殖細菌而變質(zhì)。 1.2 儀器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G型光電比色計或72型分光光度計; c. 水浴鍋; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 標準曲線的繪制 1.3.1.1 按下表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各種不同濃度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 號 試 劑 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 蒸餾水,mL ┃10 ┃ 8 ┃ 6 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0 100μg/mL酪氨酸,mL ┃ 0 ┃ 2 ┃ 4 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10 酪氨酸最終濃度,μg/ml ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100 ━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 1.3.1.2 測定步驟:取6支試管編號按表1分別吸取不同濃度酪氨酸1mL,各加入0.4mol 碳酸鈉5mL,再各加入已稀釋的福林試劑1mL。搖勻置于水浴鍋中。40℃保溫發(fā)色20min在 581-G型光電比色計上分別測定光密度(OD) (濾色片用65**#)或用72型分光光度計進行 測定(波長660nm)。一般測三次,取平均值。將1～6號管所測得的光密度(OD)減去1號管( 蒸餾水空白試驗)所測得的光密度為凈OD數(shù)。 為了清楚起見。再列出表格如下 (表2)。 表 2 ━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 號 試 劑 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 按表1制備的不同濃度酪氨酸,mL┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 0.4mol/L Na2CO3,mL ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 福林試劑,mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 1 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 2 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ O D值 ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 3 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 平均 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 凈O D值 ┃ 0 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 以凈O D值為橫坐標,酪氨酸的濃度為縱坐標,繪制成標準曲線(或可求出每度OD所相 當?shù)睦野彼崃縆)。 1.3.2 樣品稀釋液的制備。 1.3.2.1 測定酶制劑: 稱取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL,吸取此 液5mL,再用緩沖液稀釋至25mL,即成5000倍的酶粉稀釋液。 1.3.2.2 測定成曲酶: 稱取充分研細的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴內(nèi)間斷攪拌 1h,過濾,濾液用0.1mol pH 7.2磷酸鹽緩沖液稀釋到一定倍數(shù)(估計酶活力而定)。 1.3.3 樣品測定: 取15×100mm試管3支,編號1、2、3(做2只也可),每管內(nèi)加入樣品 稀釋液1mL,置于40℃水浴中預(yù)熱2min,再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1mL,精確保溫 10min, 時間到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以終止反應(yīng),繼續(xù)置于水浴中保溫20min,使 殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過濾,然后另取15×150mm試管3支,編號1、2、3,每管內(nèi)加入濾 液1mL,再加0.4mol碳酸鈉5mL,已稀釋的福林試劑1mL,搖勻,40℃保溫發(fā)色20min后進行光 密度(OD)測定。 空白試驗也取試管3支,編號(1)、(2)、(3),測定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加 0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。 為了清楚起見,分別列出表格于下 (見表3及表4)。 表 3 ━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━ ┃ 管 號 ┃ 試 劑 ┃ 管 號 試 劑 ┣━┳━┳━┫ ┣━━┳━━┳━━ ┃1 ┃2 ┃3 ┃ ┃(1) ┃(2) ┃(3) ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━ 預(yù)熱酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃預(yù)熱酶液, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━ 預(yù)熱2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃0.4mol三氯乙酸, mL ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━ 作用10min (精確計時) ┃作用10min (精確計時)┃ ┃ ━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━ 0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ┃預(yù)熱2%酪蛋白, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━ 表 4 ━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 號 試 劑 ┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃1 ┃ 2┃ 3 ┃(1) ┃(2) ┃ (3) ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 濾 液, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 0.4mol Na2CO3,mL ┃5 ┃ 5┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 福林試劑, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ O D值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━ 平均O D值 ┃ ┃ ━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━ 凈O D值 ┃ ┃ 0 ━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━ 樣品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=凈OD值。 1.4 計算 在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位。 A 1 樣品蛋白酶活力單位(干基)=━━×4×N×━━━ ……………………… (1) 10 1 - W 式中:A——由樣品測得OD值,查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K); 4——4毫升反應(yīng)液取出1 mL測定 (即4倍); N——酶液稀釋的倍數(shù); 10——反應(yīng)10min; W——樣品水分百分含量。 1.5 注意事項 以上介紹的方法用于測定中性蛋白酶(pH7.2)。若要測定酸性蛋白酶或堿性蛋白酶, 則把配制酪蛋白溶液和稀釋酶液用的pH緩沖液換成相應(yīng)pH緩沖液即可�，F(xiàn)把幾種常用pH 緩沖液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5磷酸鹽緩沖液 (0.02mol/L) 稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸 餾水溶解定容至1000mL。 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸鈉緩沖液 (0.05mol) A 液: 稱取80%～90%乳酸10.6g,加蒸餾水稀釋定容至1000mL。 B 液: 稱取70%乳酸鈉16g,加水稀釋定容至1000mL。 取A 液16mL與B 液1mL混合稀釋一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液 (0.05mol) A 液: 稱取80%～90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。 B 液: 稱取70%乳酸鈉16g,蒸餾水溶解定容至1000mL。 取A 液8mL與B 液1mL,混合稀釋一倍即成。 1.5.4 pH 10硼砂-氫氧化鈉緩沖液 A 液: 稱取硼砂19.08g,用蒸餾水溶解定容至1000mL (0.05mol)。 B 液: 稱取氫氧化鈉8g,用蒸餾水溶解定容至1000mL (0.2N)。 取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸餾水稀釋定容至1000mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼砂-氫氧化鈉緩沖液 A 液: 稱取硼砂19.08g,用蒸餾水定容至1000mL 。 B 液: 稱取氫氧化鈉4g,用蒸餾水定容至1000mL 。 取A 液與B 液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性時,須先加數(shù)滴濃乳酸,使之濕潤以加速其溶解。 2 甲醛法 成曲蛋白酶活力的測定,如用福林法測定確有困難時,可用甲醛法測定作過渡。 2.1 儀器 a. 分析天平:感量0.01g; b. 水浴鍋; c. 電烘箱; d. 容量瓶、吸管、滴定管等。 2.2 試劑與溶液 a. 1%酚酞指示劑; b. 0.1%麝香草酚藍; c. 0.1N氫氧化鈉液、甲醛(試劑配制法同氨基態(tài)氮的測定,見ZB X 66038—87《氨 基態(tài)氮測定法》)。 2.3 操作 2.3.1 目測法 稱取研細均勻的成曲樣品10g,放入250mL錐形瓶中,加55℃溫水80mL,充分搖勻,置于 55℃水浴鍋中保溫3h,取出后加熱煮沸以破壞酶活力,冷卻后定容至100mL,充分搖勻后以 脫脂棉過濾,吸取濾液10mL,移至150mL錐形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示劑0.2mL,以0.1N 氫氧化鈉標準溶液滴定至剛顯微紅色(pH 8.2),記下滴定數(shù)作為總酸,繼續(xù)加甲醛10mL,用 0.1N氫氧化鈉液滴定至深紅色(pH 8.5)為終點,若再加麝香草酚藍1mL作指示劑,則滴至紫 紅色為終點。記下滴定數(shù),減去空白數(shù)后計算成氨基態(tài)氮。另稱取曲10g做水分,再折算成 干基數(shù)。 2.3.2 酸度計法 所用儀器、藥品、操作方法等與氨基態(tài)氮測定法同 (見 ZB X 66038-87)。 2.4 計算 蛋白酶活力 (克氨基態(tài)氮/100g)(干基) (V-***Vo)×N×0.014 100 =━━━━━━━━━━×━━━ ……………………………… (2) 10 1 -W 10×━━━ 100 式中:V——加入甲醛后氫氧化鈉標準液滴定數(shù), mL; ***Vo——甲醛空白滴定數(shù), mL; W——曲水分,%; N——氫氧化鈉標準溶液的當量數(shù),N; 0.014——氮的毫克當量數(shù)。 ━━━━━━━━━ 附加說明: 本標準由商業(yè)部副食品局提出。 本標準由上海市釀造科學研究所起草。 本標準主要起草人須鳳高。 ━━━━━━━━━ *本法實質(zhì)上是在一定溫度下、一定時間內(nèi),成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋 白質(zhì)水解成氨基酸。以測定氨基態(tài)氮的量來衡量蛋白酶活力的數(shù)值。在培養(yǎng)和堆放過程, 環(huán)境溫度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。為了能和福林法的酶活力進行對照, 可用空白試驗以扣除此誤差,方法是另取一曲樣于開始時即將成曲酶活殺滅,其余操作步 驟完全相同。殺酶的方法是把已煮沸的蒸餾水70mL傾入10g成曲中,并馬上繼續(xù)把成曲液 煮沸幾分鐘,其余操作與樣品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 中華人民共和國商業(yè)部1987-11-20批準 1988-07-01實施 |
2樓2012-01-02 10:26:23
fangfang0044
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