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dudujing銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助：真菌常用的染色法
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| 各位大俠：實驗中篩到一株真菌，求助染色方法？ |
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真菌用H-E染色一般著色不良，因此需用特殊的染色方法來顯色，六胺銀法（GMS）用鉻酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基還原六胺銀內(nèi)的銀離子為黑色的金屬銀而顯色。PAS法用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游離出醛基，后者與無色品紅結(jié)合生成新的品紅色復(fù)合物而被顯色。這兩種方法可顯示大多數(shù)真菌，是最廣泛最常用的染色方法。 （一） 六胺銀染色方法(GMS) 1.操作方法： ⑴ 切片脫蠟至水。 ⑵ 8%鉻酸水溶液氧化20分鐘，自來水稍洗。 ⑶ 0.5%偏重亞硫酸鈉液處理1分鐘，流水沖洗5分鐘，再用蒸餾水洗2次。 ⑷ 浸入已預(yù)熱（約15-30分鐘）的六胺銀工作液中分三種方式處理： ①水浴鍋內(nèi)恒溫處理（50-52℃）：先將已盛有六胺銀工作液的5片裝高身染色缸置入水浴鍋內(nèi)預(yù)熱15-30分鐘，再將處理好的玻片置入六胺銀工作液中反應(yīng)30-60分鐘，中途顯微鏡觀察，至見到菌絲呈黑褐色為止。 ②電熱恒溫箱內(nèi)處理（58℃-60℃）：方法同上，在六胺銀工作液中反應(yīng)的時間較長需60-90分鐘, 蒸餾水稍洗. ③微波爐滴染：取微波爐專用蒸盒，底放50ml水，用于吸熱保濕；玻片放置隔層，滴加六胺銀工作液于組織上，火力3檔5-6分鐘,蒸餾水稍洗. ⑸ 滴加0.1%氯化金溶液調(diào)色2-3分鐘,蒸餾水洗。 ⑹ 3%硫代硫酸鈉液處理2-5分鐘, 流水沖洗5分鐘。 ⑺ 用橙黃G復(fù)染1-2秒（首選）或用Mayer氏蘇木素淺染，伊紅復(fù)染。 ⑻ 常規(guī)脫水透明封片。 2．染色結(jié)果： 各種真菌均被著色，菌絲和孢子呈明顯的黑褐色。背景為：橙黃色（橙黃G復(fù)染），紅色（伊紅復(fù)染）。 ※3．注意事項： 六胺銀染色是顯示真菌效果最佳的一種方法，為了獲得菌體及背景清晰的染色效果，首先必須做好準(zhǔn)備工作，染色過程需用的玻璃器皿要潔凈，盡量避免使用過久的蒸餾水配制試劑，建議使用雙蒸水，這樣才能保證六胺銀工作液的純度，避免雜質(zhì)沉淀影響觀察。其次病理技術(shù)人員應(yīng)掌握常見真菌的一般形態(tài)特征，并根據(jù)實驗室的具體情況選擇合適的孵育條件，摸索孵育時間和溫度。在顯微鏡下觀察染色程度時，低倍鏡下顏色不要太黑，至深棕褐色即可，經(jīng)0.1%氯化金溶液調(diào)色后，真菌從深棕褐色變成棕黑色，真菌壁和孢子著色。 4．過染的補救措施： 可用1%鐵氰化鉀與2%硫代硫酸鈉1:1混合備用，臨用時將此混合液再稀釋2-3倍，滴入玻片上使組織減色，鏡下觀察。 （二） 高碘酸—無色品紅(PAS) 法 1．操作方法： (1) 切片脫蠟至水。 (2) 0.5%高碘酸氧化5-8分鐘。 (3) 流水沖洗2分鐘，再用蒸餾水洗。 (4) 入無色品紅液于暗處并加蓋作用10-20分鐘。 (5) 0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次，每次約1分鐘。 (6) 流水沖洗5分鐘。 (7) 0.2%亮綠水溶液復(fù)染。 (8) 稍水洗。 (9) 常規(guī)脫水透明封片． 2．染色結(jié)果： 真菌菌絲和孢子呈品紅色，其他組織綠色 3．注意事項： 無色品紅液(Schiff氏試劑)的試劑配制主要是試劑的純度要高，才能配制出理想的無色品紅液，染色才能成功。 （三） 銀氨液浸染法（G-S法） 1.操作方法： (1) 切片脫蠟至水 (2) 切片滴入0.5%酸化高錳酸鉀液，氧化5分鐘，稍水洗。 (3) 2%草酸水溶液漂白1-2分鐘，稍水洗。 (4) 2%硫酸鐵銨水溶液媒染5分鐘，再用蒸餾水洗一次。 (5) 滴入G-S氏銀氨液作用10-30秒，蒸餾水稍洗。 (6) 10%中性甲醛液還原30秒，流水沖洗數(shù)分鐘。 (7) 滴加0.1%氯化金溶液調(diào)色2-3分鐘（鏡下觀察），水稍洗。 (8) 3%硫代硫酸鈉液處理2-5分鐘（鏡下觀察），流水沖洗5-10分鐘。 (9) 核固紅液復(fù)染5-10分鐘，稍水洗，常規(guī)脫水透明封片。 2.染色結(jié)果： 網(wǎng)狀纖維及真菌呈棕黑色，胞核紅色（核固紅復(fù)染）， 膠原纖維黃棕色，胞質(zhì)淡紅色（伊紅復(fù)染）。 3.注意事項： ⑴ 配制銀氨液的蒸溜水要純，滴入銀氨液作用不要超過1分鐘，最好控制在10-30秒已足。 ⑵ 10%中性甲醛還原不要超過1分鐘，最好控制在30秒，否則容易出現(xiàn)銀氨沉淀，影響觀察。 幾種真菌的顯示特點 1．新形隱球菌在鏡下多呈圓形，直徑為4-20微米 ，菌體周圍有一層寬闊的具有折光性的膠質(zhì)樣莢膜包繞，莢膜厚3-5微米，為一種粘多糖物質(zhì)所組成，愛先藍染色和粘液胭脂紅染色呈陽性反應(yīng)。六胺銀染色也能很好地顯示菌體的特征，但必須掌握染色程度，顯色太淺，隱球菌的夾膜不明顯，顯色太深，則分不清夾膜和菌體。 2． 組織胞漿菌病的感染途徑是通過吸入莢膜型組織胞漿菌的分生孢子后感染所致的全身性真菌病，主要侵犯機體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。組織胞漿菌病是一種典型的雙相性真菌，在人體組織中是酵母型，大部分病變中均可在巨噬細(xì)胞內(nèi)找到很多的病原菌。HE染色見菌體為小圓形或卵圓形，直徑很小只有1-5um，有明顯的細(xì)胞壁。PAS染色（首選）菌細(xì)胞壁陽性。六胺銀染色也能清晰的見到病原菌，菌細(xì)胞壁呈黑色。 3．馬爾尼菲青霉菌是較罕見的真菌病，是已知唯一的雙相性青霉菌，該菌在人體組織中酷似組織胞漿菌，其鏡下是一種2.5-3微米的圓形或橢圓形酵母細(xì)胞，它所具有的特征性標(biāo)志是臘腸形分隔的孢子。本病易與組織胞漿菌混淆，（1）組織胞漿菌在組織胞漿內(nèi)呈淡藍色核點，周圍有空暈，但無“臘腸”狀菌體、中部無橫隔。（2）馬爾尼菲青霉菌有雙相性，即在不同溫度下培養(yǎng)呈不同形態(tài)。25℃培養(yǎng)呈灰褐色絨毛狀菌落，培養(yǎng)基呈玫瑰紅色，鏡下為菌絲相；37℃培養(yǎng)呈灰褐色粗糙的酵母樣菌落，鏡下為酵母相。組織胞漿菌雖然也有雙相性，但不產(chǎn)生紅色色素。六胺銀染色（首選）可以很好地顯示出它的特征，但要熟練掌握好溫度和時間，建議用橙黃G復(fù)染，這樣底色清晰，能更好的發(fā)現(xiàn)橢圓形或臘腸狀的菌體,中央有一著色較深較粗的橫壁。馬爾尼非青霉菌的淋巴結(jié)組織不適合選用銀氨G-S染色方法；PAS染色也很難發(fā)現(xiàn)橢圓形或臘腸形分隔的孢子。 4．念珠菌為圓形或橢圓形生芽的酵母樣菌，壁簿，由芽管延長而形成的假菌絲長而直，有分隔，少數(shù)有分枝，芽生孢子和假菌絲同時見到才可診斷為念珠菌，通常陳舊性病灶或病灶深部菌絲較多，而病灶淺部的孢子較多。六胺銀法和PAS法都能很好地顯示出念珠菌的孢子和假菌絲。 5． 煙曲霉的營養(yǎng)菌絲體由具有橫隔的分支菌絲構(gòu)成，在切片內(nèi)有時可以清楚的看到孢子；分生孢子頭短柱形，長短不一；分生孢子梗光滑，近頂端膨大形成倒立燒瓶狀頂囊。頂囊有單層小梗，較長，黑棕色密集排列呈柵狀，布滿頂囊表面4/5。 6． 曲霉是較常見的一種真菌，營養(yǎng)菌絲體由具有橫隔的分支菌絲構(gòu)成，粗細(xì)均勻，兩側(cè)菌絲壁平行，有橫隔，常呈45度銳角分枝，呈放射狀或珊瑚狀排列。曲菌常在組織空腔內(nèi)大量繁殖，其菌絲纏繞在一起形成團塊，稱曲菌球。六胺銀法、PAS法和銀氨G-S法染色都能很好地顯示菌絲體，營養(yǎng)菌絲體著色較深，反之著色較淺。 7．毛霉菌主要侵犯肺，腦和其它器官,最常侵犯血管引起血栓形成和血道播散，毛霉菌菌絲粗大,壁厚，兩側(cè)壁不對稱 ,寬窄不均,不分隔 ,菌絲偶有分枝而不規(guī)則,呈鈍角或直角分枝,有時菌絲可呈直管狀 ,有些又像枯枝狀。用六胺銀法、PAS法和銀氨G-S法都能很好地顯示毛霉菌菌體。 8．放線菌按生物學(xué)分類屬于細(xì)菌，有細(xì)胞壁，其化學(xué)組成與細(xì)菌相似；由于所引起的病變與真菌相似，故多把它歸為真菌類介紹。 近年來，由于臨床上大量使用廣譜抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及進行大量的放療，其結(jié)果造成機體內(nèi)菌群失調(diào)和菌群交替，使作為條件致病的放線菌引起的機會性感染發(fā)病率急劇上升。 放線菌的菌落由大量菌絲交織而成，周邊部分菌絲成放射狀排列，故稱為放線菌。H-E染色中可見放線菌叢（肉眼觀察為硫磺樣小顆粒）。菌叢中央由交織成團的菌絲構(gòu)成，呈紫藍色，周邊部分為放射狀排列的菌絲未端，呈棒狀膨大和紅染。革蘭氏染色陽性。六胺銀染色能把菌絲和膠樣鞘都顯示出來。放線菌常侵犯人的頸面部，腹部和胸部亦可侵犯腸壁、肝和肺。 三種染色方法的比較 1. 六胺銀染色 ① 六胺銀染色能顯示大多數(shù)真菌,是顯示真菌效果最佳的一種方法。 ② 本實驗中的7種真菌和1種細(xì)菌染色效果都十分理想。 ③ 六胺銀染色能很好的將真菌特點顯示出來。 ④ 六胺銀染色中的微波爐滴染方法由于大部分使用家用微波爐,不能控制溫度,效果不穩(wěn)定。 ⑤ 六胺銀染色操作雖然繁瑣,技術(shù)要求較多，需要積累并不斷總結(jié)經(jīng)驗，才能獲得菌體及背景清晰的染色效果。 2．PAS染色 ① 操作簡單,時間短，不容易過染。 ② 能較好的顯示大多數(shù)真菌,包括單細(xì)胞型和多細(xì)胞型真菌。 ③ 個別真菌局部著色不良。 ④ 建議做PAS染色時也做六胺銀染色,有利于觀察判斷。 3．銀氨G-S染色法 ① 操作簡單,時間短,只需十幾分鐘. ② 能顯示大多數(shù)真菌（較適合染多細(xì)胞型真菌）。由于大量的網(wǎng)狀纖維影響觀察，故不適合染淋巴結(jié)內(nèi)真菌感染的切片。 綜上所述，三種染色方法各有利弊，其中六胺銀染色是顯示真菌效果最佳的一種方法，并且能顯示另外兩種方法所不能顯示的真菌結(jié)構(gòu)，對真菌病的診斷具有確診的價值。 ------------------------------------------ 來源網(wǎng)絡(luò)整理 Ps附件一份，以絲核真菌為例的集中方法比較。 |
2樓2012-01-06 09:51:19
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2012-01-06 09:52:25, 146.08 K
3樓2012-01-06 09:52:26
【答案】應(yīng)助回帖
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wingaboy
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