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微量樣品酶催化時(shí)用什么裝置？氬氣保護(hù)情況下怎么進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè)？
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aten
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我給你查到一點(diǎn)東西，你可以參考下 高效液相色譜法測(cè)定雷帕霉含量 發(fā)表時(shí)間：2011-11-2 17:33:39 來(lái)源：創(chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)醫(yī)學(xué)編輯部 齊 利 河南省安陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所(455000) 摘要：詳述了一種建立高效液相色譜法測(cè)定局部組織中雷帕霉素含量的實(shí)驗(yàn)方法，該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，為進(jìn)一步研究局部應(yīng)用雷帕霉素抑制血管再狹窄提供保障。 關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;雷帕霉素;藥物含量 文章編號(hào)：1672-2779(2010)-18-0238-02 雷帕霉素是一種內(nèi)酯類抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管內(nèi)膜增生的作用。雷帕霉素涂層支架技術(shù)在預(yù)防介入治療后冠脈再狹窄上已取得了明顯的效果;并且，也有研究發(fā)現(xiàn)血管周圍局部應(yīng)用雷帕霉素也能抑制冠脈搭橋術(shù)后橋靜脈的再狹窄。以上均為藥物的局部應(yīng)用。且已成為目前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬在建立高效液相色譜法測(cè)定局部組織中雷帕霉素含量的方法，用于研究其局部藥代動(dòng)力學(xué)。 1 試劑儀器與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.1 儀器 Agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó))：三元梯度，微量標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外一可見(jiàn)監(jiān)測(cè)器，柱溫樣品溫控：Startorious1712型電子天平(德國(guó));XW一80A渦旋混合器;TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)。 1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純;硫酸鋅、丙酮、乙醚、正己烷為分析純;水為超純水。雷帕霉素對(duì)照品(純度：99.4%，高效液相色譜法測(cè)定)。 1.3 動(dòng)物普通級(jí)封閉群 大耳白兔，體重2.5～3.0kg。 1.4 方法與結(jié)果 1.4.1 色譜條件色譜柱 為Alltech C18(250mm×4.6mm，5μm)，預(yù)柱：Alltech C18(7.5mm×4.6mm，5μm)。流動(dòng)相為乙腈：四氫呋喃：水(55:5:40);檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm，流速為1.2ml/min，柱溫60℃。 1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取兔正常頸外靜脈、組織勻漿，方法同上。分裝于EP管中，置-20℃冰箱中�？瞻籽軜颖緞驖{液保存?zhèn)溆�。分別配制雷帕霉素溶液6.4、3.2、1.6、0.8～0.4、0.2ug/ml，各取10ul于離心管中分別加人空白m管樣本勻漿液0.5ml，充分混勻后，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)組織濃度為128、64、32、16、8、4ng/ml。22℃水浴5min，用N2吹干醚層，加150ul流動(dòng)相于試管中，密塞，渦旋混勻15min，加500ul正己烷于試管中，渦旋混勻30s.8000xg離心10min，吸棄上層正己烷，下層溶液置22℃水浴中，用N2吹去殘留的正己烷及部分丙酮，至總?cè)萘繛?ml，取100ul進(jìn)樣測(cè)定。 1.4.3 樣品溶液的制備 手術(shù)取兔的一側(cè)頸外靜脈，長(zhǎng)約3cm，于其周圍涂布攜0.3mg雷帕霉素的Pluronic F-127凝膠。術(shù)后1、2、4、8周取材。去除3cm血管的兩端，取其中段，收集標(biāo)本。剝除血管周圍脂肪組織，生理鹽水沖洗至無(wú)殘留血液，濾紙吸干表面液體。稱重2g，眼科剪剪碎，加人1ml丙酮予以勻漿。勻漿液3500xg離心10min，按1.4.2項(xiàng)操作后，進(jìn)樣100ul作高效液相色譜法分析。 2 結(jié)果 2.1 色譜條件及方式 本色譜條件下，樣品檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)有對(duì)雷帕霉素的干擾峰。以雷帕霉素峰面積A為縱坐標(biāo)，藥物濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸�；貧w方程為：A=3.2481C+7.4082×10-3,r=0.9925。在4～128ng/ml范圍內(nèi)線性良好。 2.2 精密度試驗(yàn) 吸取同一對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，雷帕霉素峰面積RSD值為0.54%。 2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取雷帕霉素5份，每份1mg，制備樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜法分析，雷帕霉素含量RSD為1.9%。 2.4 樣品測(cè)定 據(jù)回歸方程，計(jì)算出藥物濃度(表1)�？梢�(jiàn)血管外涂攜雷帕霉素的Pluronic F-127凝膠，血管組織內(nèi)藥物含量隨時(shí)間遞減，但在8周內(nèi)仍可有一定劑量的藥物殘留。 3 討論 3.1 色譜柱的選擇 筆者多次對(duì)不同的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)色譜柱Alltech C18(250mm×4.6mm，5μm)對(duì)雷帕霉素藥物濃度檢測(cè)的靈敏度較高，波形較好，故選擇此柱。同時(shí)，考慮到生物組織勻漿樣品中雜質(zhì)較多，為延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，使用了預(yù)柱AIItech C18 (7.5mm×4.6mm。5μm)。 3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將配制的雷帕霉素溶液，用紫外波長(zhǎng)190～400nm掃描，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在278nm時(shí)有最大的吸收峰。故選擇265nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 3.3 流動(dòng)相的選擇 在對(duì)流動(dòng)相體系進(jìn)行摸索的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例對(duì)分析結(jié)果有的影響。選擇乙腈：四氫呋喃：水(55:5:40)為流動(dòng)相，雜質(zhì)峰對(duì)樣品峰干擾小，保留時(shí)間適宜。 3.4 流速和柱溫的選擇 流速和柱溫影響著雷帕霉素的洗脫開(kāi)寸間及波形，較高的流速和較高的柱溫可以使洗脫時(shí)問(wèn)更短波形較好。但過(guò)高的流速會(huì)增加整個(gè)色譜系統(tǒng)的壓力，過(guò)高的溫度會(huì)損壞色譜柱及其它關(guān)鍵元器件。經(jīng)過(guò)摸索，選擇流速1.2ml/min，柱溫60℃。 3.5 樣品的預(yù)處理 雷帕霉素的血藥濃度的高效液相色譜法檢測(cè)已經(jīng)有了比較成熟的方法 。在對(duì)血管的預(yù)處理時(shí)。筆者在血樣預(yù)處理方法的基礎(chǔ)上加入了切碎和勻漿，并在勻漿中加人了1ml丙酮，以加大對(duì)血管壁內(nèi)雷帕霉素的回收。結(jié)果表明：檢測(cè)方法滿意。 本法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可用于測(cè)定局部血管組織中雷帕霉素含量，研究其藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布,為進(jìn)一步研究局部應(yīng)用雷帕霉素抑制血管再狹窄提供保障。 |
4樓2012-02-23 14:48:37
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