li-spring

應(yīng)助: 4 (幼兒園)
金幣: 3067.6
帖子: 1312
在線: 978.9小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 977934

[交流] 連接轉(zhuǎn)化

本人用Pet30質(zhì)粒作載體，選擇Nco1、BamH1作雙酶切，然后連接1000bp左右的基因片段，轉(zhuǎn)化DH5a菌，前后做了六次了，要么平板上就不長(zhǎng)菌，要么就長(zhǎng)的很慢，48小時(shí)后才出現(xiàn)很小的菌落，第三次挑了12個(gè)菌，到液體LB里面也足足長(zhǎng)了48小時(shí)才出來(lái)，提了質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)目的片段幾乎沒(méi)有，請(qǐng)教各位大蝦怎么辦？感受態(tài)是買的新的

回復(fù)此樓

» 猜你喜歡

蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體已經(jīng)有0人回復(fù)
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)? 已經(jīng)有232人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千” 已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù)
納米粒度分析已經(jīng)有3人回復(fù)
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京已經(jīng)有0人回復(fù)
留學(xué)--博士招生已經(jīng)有16人回復(fù)
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限已經(jīng)有4人回復(fù)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼

1樓 2012-02-26 10:43:44

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

joan198108

鐵桿木蟲(chóng) (正式寫手)

MolEPI: 2
應(yīng)助: 107 (高中生)
金幣: 6525.2
帖子: 842
在線: 413.5小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 859607

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與
1949stone(金幣+1): 希望不是 2012-02-26 19:34:13

是不是你的基因表達(dá)蛋白對(duì)感受態(tài)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種毒蛋白啊

贊一下

回復(fù)此樓

2樓2012-02-26 13:37:47

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

liuyu_sdili

木蟲(chóng) (正式寫手)

MolEPI: 1
應(yīng)助: 53 (初中生)
金幣: 3045.9
帖子: 394
在線: 311.7小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1130112

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與
1949stone(金幣+2): 學(xué)習(xí)下 2012-02-26 19:34:42
li-spring(金幣+2): 轉(zhuǎn)化的菌生長(zhǎng)速度超慢，要足足兩天才能長(zhǎng)起來(lái)是怎么回事啊 2012-02-26 21:30:23

首先，你挑的菌空質(zhì)粒能提出來(lái)嗎？
如果空載體轉(zhuǎn)進(jìn)去的都很少，那說(shuō)明可能是感受態(tài)或者是連接有問(wèn)題~~~
樓上說(shuō)蛋白有毒性，個(gè)人并不贊同，因?yàn)閜ETz做表達(dá)應(yīng)該用BL21才對(duì)，不是用DH5a，樓主顯然只是想讓質(zhì)粒在DH5a菌里面保存，并不是做表達(dá)~~~

贊一下

回復(fù)此樓

3樓2012-02-26 14:07:19

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

青菜小蟲(chóng)

銀蟲(chóng) (著名寫手)

MolEPI: 5
應(yīng)助: 16 (小學(xué)生)
金幣: 1666.5
帖子: 1111
在線: 352.2小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1332002

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與
1949stone(金幣+1): 有道理 2012-02-26 19:34:57

借一個(gè)感受態(tài)做個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，新買的也不一定是好用的。

贊一下

回復(fù)此樓

4樓2012-02-26 15:08:25

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

panda73

金蟲(chóng) (小有名氣)

MolEPI: 3
應(yīng)助: 80 (初中生)
金幣: 1201.3
帖子: 191
在線: 42.5小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 985964

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與
1949stone(金幣+1): 抗性搞錯(cuò)了？？ 2012-02-26 19:35:24

pET30是卡那抗性，你沒(méi)搞錯(cuò)吧

贊一下

回復(fù)此樓

5樓2012-02-26 15:16:53

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

li-spring

木蟲(chóng) (著名寫手)

應(yīng)助: 4 (幼兒園)
金幣: 3067.6
帖子: 1312
在線: 978.9小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 977934

引用回帖:

樓: Originally posted by joan198108 at 2012-02-26 13:37:47:
是不是你的基因表達(dá)蛋白對(duì)感受態(tài)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種毒蛋白啊

還沒(méi)有誘導(dǎo)表達(dá)的啊，現(xiàn)在做到DH5a里的

贊一下

回復(fù)此樓

6樓2012-02-26 21:27:13

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

li-spring

木蟲(chóng) (著名寫手)

應(yīng)助: 4 (幼兒園)
金幣: 3067.6
帖子: 1312
在線: 978.9小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 977934

引用回帖:

樓: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-02-26 14:07:19:
首先，你挑的菌空質(zhì)粒能提出來(lái)嗎？
如果空載體轉(zhuǎn)進(jìn)去的都很少，那說(shuō)明可能是感受態(tài)或者是連接有問(wèn)題~~~
樓上說(shuō)蛋白有毒性，個(gè)人并不贊同，因?yàn)閜ETz做表達(dá)應(yīng)該用BL21才對(duì)，不是用DH5a，樓主顯然只是想讓質(zhì)粒在DH ...

有兩個(gè)提出來(lái)了，但條帶大小不對(duì)，感覺(jué)是空載體，還有轉(zhuǎn)化的菌一般過(guò)夜就長(zhǎng)出來(lái)，我這個(gè)足足長(zhǎng)了兩天，而且菌斑很小，不曉得是什么原因，挑了12個(gè)菌，最后只有兩個(gè)長(zhǎng)出來(lái)了，質(zhì)粒提了之后條帶不對(duì)

贊一下

回復(fù)此樓

7樓2012-02-26 21:29:28

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

天使托

專家顧問(wèn) (職業(yè)作家)

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與
西瓜(金幣+2): 歡迎天使歸來(lái)！ 2012-02-26 23:54:21

一般情況下，單克隆如果沒(méi)有問(wèn)題，就要考慮你連接的問(wèn)題了‘
1：質(zhì)粒和目的片段是否酶切的干凈，并且保證是否純化干凈？
2：連接體系合適與否？當(dāng)然了。。。這要取決于你載體的大小和基因的大小了
祝好運(yùn)！

贊一下

回復(fù)此樓

8樓2012-02-26 21:34:46

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

liuyu_sdili

木蟲(chóng) (正式寫手)

MolEPI: 1
應(yīng)助: 53 (初中生)
金幣: 3045.9
帖子: 394
在線: 311.7小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1130112

引用回帖:

7樓: Originally posted by li-spring at 2012-02-26 21:29:28:
有兩個(gè)提出來(lái)了，但條帶大小不對(duì)，感覺(jué)是空載體，還有轉(zhuǎn)化的菌一般過(guò)夜就長(zhǎng)出來(lái)，我這個(gè)足足長(zhǎng)了兩天，而且菌斑很小，不曉得是什么原因，挑了12個(gè)菌，最后只有兩個(gè)長(zhǎng)出來(lái)了，質(zhì)粒提了之后條帶不對(duì)

這個(gè)搞得我也有點(diǎn)暈。。。。。。

贊一下

回復(fù)此樓

9樓2012-02-27 07:56:23

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

考研生涯

金蟲(chóng) (正式寫手)

應(yīng)助: 13 (小學(xué)生)
金幣: 3515.7
帖子: 714
在線: 342.9小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1271180

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與

質(zhì)粒提出來(lái)后跑膠，由于是超螺旋可能無(wú)法判斷目的基因是否插入，你可以做個(gè)菌落PcR，或者將提的質(zhì)粒單酶切以后再看看.

贊一下

回復(fù)此樓

10樓2012-02-27 09:44:06

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zoeye

金蟲(chóng) (小有名氣)

MolEPI: 1
應(yīng)助: 16 (小學(xué)生)
金幣: 1411
帖子: 278
在線: 53小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 893815

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與

說(shuō)不定不適合轉(zhuǎn)這種感受態(tài)呢有的在DH5ALPHA里是長(zhǎng)不起來(lái)的

贊一下

回復(fù)此樓

11樓2012-02-27 10:59:20

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

watercity

金蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 4 (幼兒園)
金幣: 950.7
帖子: 63
在線: 71.4小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 128903

★
li-spring(金幣+1):謝謝參與

很有可能是感受態(tài)的問(wèn)題吧，最好重新用個(gè)感受態(tài)。

贊一下

回復(fù)此樓

12樓2012-02-27 15:04:41

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

wcx蝸牛

無(wú)蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 2 (幼兒園)
金幣: -5.6
帖子: 106
在線: 29.6小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1475396

★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖

引用回帖:

8樓: Originally posted by 天使托 at 2012-02-26 21:34:46:
一般情況下，單克隆如果沒(méi)有問(wèn)題，就要考慮你連接的問(wèn)題了‘
1：質(zhì)粒和目的片段是否酶切的干凈，并且保證是否純化干凈？
2：連接體系合適與否？當(dāng)然了。。。這要取決于你載體的大小和基因的大小了
祝好運(yùn)！

你好，我近期也在做酶切連接，請(qǐng)問(wèn)怎樣驗(yàn)證質(zhì)粒和目的片段是否酶切干凈？
謝謝

贊一下

回復(fù)此樓

13樓2012-03-03 20:02:30

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

xiazhiwuxie

銀蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
金幣: 101.6
帖子: 94
在線: 40.4小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1149752

★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖

建議你把抗生素的濃度降低，不長(zhǎng)菌有可能是篩選壓力太大了，長(zhǎng)了很久的可能是突變的菌，所以你挑出來(lái)也沒(méi)有

贊一下

回復(fù)此樓

14樓2012-03-04 14:01:44

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]	作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 320分，材料與化工專業(yè)，求調(diào)劑 +7	一定上岸aaa 2026-03-27	9/450	2026-03-28 07:07 by wangy0907
[考研] 070300化學(xué)求調(diào)劑 +4	起個(gè)名咋這么難 2026-03-27	4/200	2026-03-27 21:39 by 83503孫老師
[考研] 266分求材料化工冶金礦業(yè)等專業(yè)的調(diào)劑 +4	哇呼哼呼哼 2026-03-26	4/200	2026-03-27 17:02 by zhyzzh
[考研] 材料與化工（0856）304求B區(qū)調(diào)劑 +7	邱gl 2026-03-27	7/350	2026-03-27 15:27 by Joe率
[考研] 08開(kāi)頭275求調(diào)劑 +4	拉誰(shuí)不重要 2026-03-26	4/200	2026-03-27 14:12 by Delta2012
[考研] 一志愿鄭大085600，310分求調(diào)劑 +5	李瀟可 2026-03-26	5/250	2026-03-27 11:14 by 不吃魚(yú)的貓
[考研] 0703化學(xué)一志愿南京師范大學(xué)303求調(diào)劑 +3	zzffylgg 2026-03-24	3/150	2026-03-27 10:42 by shangxh
[考研] 304材料求調(diào)劑 +4	鐘llll 2026-03-26	4/200	2026-03-27 03:42 by wxiongid
[考研] 一志愿北化求調(diào)劑 +3	Jsman 2026-03-22	3/150	2026-03-26 21:06 by ajpv風(fēng)雷
[考研] 327求調(diào)劑 +7	prayer13 2026-03-23	7/350	2026-03-26 20:48 by 不吃魚(yú)的貓
[考研] 生物學(xué)學(xué)碩，一志愿湖南大學(xué)，初試成績(jī)338 +4	YYYYYNNNNN 2026-03-26	4/200	2026-03-26 19:00 by macy2011
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)材料與化工（085600）296求調(diào)劑 +9	稻妻小編 2026-03-26	9/450	2026-03-26 16:16 by 不吃魚(yú)的貓
[考研] 材料科學(xué)與工程 317求調(diào)劑 +4	JKSOIID 2026-03-26	4/200	2026-03-26 15:58 by 不吃魚(yú)的貓
[考研] 297求調(diào)劑 +6	田洪有 2026-03-26	6/300	2026-03-26 15:55 by 不吃魚(yú)的貓
[考研] 263求調(diào)劑 +6	yqdszhdap－ 2026-03-22	10/500	2026-03-26 13:11 by 公瑾逍遙
[考研] 一志愿上海交大生物與醫(yī)藥專碩324分，求調(diào)劑 +6	jiajunX 2026-03-22	6/300	2026-03-25 23:05 by licg0208
[考研] 303求調(diào)劑 +6	藍(lán)山月 2026-03-25	6/300	2026-03-25 22:47 by 418490947
[考研] 材料與化工328分調(diào)劑 +6	。，。，。，。i 2026-03-23	6/300	2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 求調(diào)劑一志愿武漢理工大學(xué)材料工程（085601） +5	WW.' 2026-03-23	7/350	2026-03-24 14:50 by sprinining
[考研] 335求調(diào)劑 +4	yuyu宇 2026-03-23	5/250	2026-03-23 23:49 by Txy@872106