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質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳
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（一）堿變性法提取質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒(Plasmid) 是細菌染色體外能自身獨立復制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息，可賦予細菌某些新的表型。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒DNA探針技術及檢測質(zhì)粒的PCR技術用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學調(diào)查已成為現(xiàn)實。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著重要的作用。 分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個步驟：即細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴增，細菌菌體的裂解; 質(zhì)粒DNA的提取與純化。 本實驗學習用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA。 【原理】 細菌培養(yǎng)物加入SDS和NaOH 堿性溶液處理后，菌體裂解，可使細菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內(nèi)釋放出來，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠（EB）染色后，在紫外線燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據(jù)熒光的位置，可區(qū)分不同的核酸帶。 【材料】 1．菌株 E.coli JM109（pUC19），E.coli RRI（pBR322） 2．試劑 溶液Ⅰ( 50 mM葡萄糖, 25 mM Tris.Hcl PH 8.0, 10 mM EDTA) 溶液 II ( 0.2 N NaOH，1%SDS) 用前新配制 溶液III ( 5 mM KAc溶液PH4.8) TE緩沖液 (10mMTris.Hcl ,1mMEDTA PH8.0) LB液體培養(yǎng)基( 胰蛋白胨 10g,，酵母粉5g, Nacl 10g. 加蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)PH 至7.5，加水至1000 ml,15磅高壓滅菌15分鐘)。 【方法】 1．接種細菌于5ml LB液體培養(yǎng)基中，370C培養(yǎng)過夜。 2．3000 rpm/min,離心15min，棄上清。加入100ul 溶液1懸起細菌沉淀。 3．加入200ul前新配制的溶液II ，顛倒EP管5次混合均勻，置冰浴2min。 4．加入150ul溶液III溫和地混勻，12000 rpm/min,離心5min。 5．吸取上清清亮裂解液放入另一新EP 管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次，12000 rpm/min,離心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP 管中，加入二倍體積的冷乙醇，12000 rpm/min,離心10min。 6．棄乙醇，干燥后用30ul TE緩沖液洗下核酸，待電泳檢測。 （二）瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳技術（Agarose gel electroghoresis）是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個電場作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應，此外，在弱堿性條件下，DNA分子帶負電荷，從負極向正極移動。根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過介質(zhì)運動而相互分離。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結(jié)合的作用，利用EB染色，并通過紫外線激發(fā)即可觀察被分離DNA片段的位置。 【材料】 1．瓊脂糖、10×TAE電泳緩沖液（40m MTris ,20 mM NaAc,1mM EDTA PH8.0） 2．載體緩沖液（0.25%溴酚藍，30%甘油）、溴化乙錠水溶液（10mg/ml ） 3．凝膠槽、電泳儀 【方法】 1．取瓊脂糖0.9g，加入100ml 1x TAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，1000C加熱溶解。 2．平衡凝膠槽，放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離（一般高出底板0.5~1mm）。 3．鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml 的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至500C左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5~8mm。 4．待膠徹底凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負極端，DNA由負極向正極移動），使液面高出凝膠2~3mm，小心拔出梳子。 5．DNA 樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）。 6．打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長度有關，一般使用電壓不超過5v/cm。 7．據(jù)指示染料移動的位置，確定電泳是否終止（溴酚藍的涌動距離在5s RNA和0.3 kb DNA 帶之間）。 8．電泳完畢關閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。 |
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