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lipei98989新蟲 (小有名氣)
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關(guān)于免疫組化SABC法的一些疑惑？ 已有1人參與
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我的本科畢業(yè)論文，實(shí)驗(yàn)技術(shù)是免疫組化SABC法，最近一直在試圖徹底弄懂這套技術(shù)的整個原理，仍有幾點(diǎn)疑惑，望大家能為我指點(diǎn)迷津： 比方說我要做的是對動物A生長抑制素的定位及定量，那么我的簡單理解是：用動物A中的生長抑制素（純抗原）去接種動物B，使其產(chǎn)生單克隆性的一抗（1種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的），再用此單克隆性一抗接種動物C,使其產(chǎn)生相應(yīng)的多克隆性抗體(此抗體是多種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的)(另外就是未用一抗接種動物C時，動物C的血清液可作為封閉液)，把二抗和生物素結(jié)合上，與二抗結(jié)合的生物素再和霉鏈親和素結(jié)合（霉鏈親和素能與4個生物素結(jié)合），霉鏈親和素再結(jié)合另外三個生物素，另外的三個生物素外連接的是辣根過氧化物酶，最后又辣根過氧化物酶催化二氨基聯(lián)苯胺（DAB）得棕色沉淀物而顯色。 有幾點(diǎn)疑惑： 1.這套技術(shù)最根本的起點(diǎn)是抗原，那這個抗原一般是在動物組織中哪？比如我認(rèn)為：生長抑制素可在分泌該物質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)中（核膜、細(xì)胞膜上不知會不會附著），組織液中，前者的話，我覺得，這樣定位、定量才有意義，就是把原細(xì)胞定出來了，若是后者的話有何意義？？其它像什么5-HT,NPY等呢？ 2.關(guān)于未經(jīng)一抗免疫處理的封閉液血清（和二抗是相同動物的來源）怎么就能封閉掉原抗原動物體內(nèi)對一抗的非特異性吸附呢？封閉液血清的封閉原理？？ |
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liujiali006
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1、用IHC方法檢測生長抑素，陽性信號應(yīng)該在細(xì)胞質(zhì)中，5-HT和NPY也如此。即便是IHC檢測存在于胞膜上的某些抗原如激素的膜受體，從切片的最終結(jié)果（DAB）上看，也象是胞質(zhì)顯色（免疫熒光的方法可能好些）。不同的抗原存在于細(xì)胞中的位置不同，如核受體及轉(zhuǎn)錄因子一般存在于胞核中，激素及遞質(zhì)類物質(zhì)存在于胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的載體和胞膜受體存在于胞膜上，這些可從文獻(xiàn)中得到基本信息。 2、封閉的問題：理論上，組織上的游離醛基會與蛋白發(fā)生非特異結(jié)合，而我們用的二抗即IgG是蛋白質(zhì)，當(dāng)我們用與二抗相同來源的未免疫血清（含大量IgG）作了封閉后，標(biāo)記二抗就只能和已與組織內(nèi)抗原發(fā)生特異結(jié)合的一抗發(fā)生反應(yīng)，從而防止非特異反應(yīng)的發(fā)生。 不知道說清楚沒有。 祝 順利！ |
lipei989892樓2012-03-06 11:19:54
lipei98989
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3樓2012-03-06 12:56:54
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4樓2012-03-06 14:07:56
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