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[交流] 內(nèi)切酶和連接酶buffer的選擇

體系中需要加入連接酶和內(nèi)切酶，那buffer怎么辦呢？?jī)蓚€(gè)buffer成分差不多，如果10微升體系，那buffer是各加1微升10*的，還是加一個(gè)就可以了呢？更或者說，每個(gè)都加0.5微升？？？
如果兩個(gè)buffer都加的話，那溶液中鹽離子濃度會(huì)不會(huì)太高了呢？會(huì)不會(huì)影響酶的活性？

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1樓 2012-03-11 21:59:31

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又連接又切？？？孤陋寡聞了，這是什么情況？

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2樓2012-03-12 10:21:11

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dorecnu

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請(qǐng)樓主先解釋一下，您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘裁�？為什么不酶切后回收片段，然后再連接。在避免了buffer不同的同時(shí)每一步都可以檢測(cè)，便于后面設(shè)置連接反應(yīng)。

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5樓2012-03-12 12:01:10

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好想見識(shí)見識(shí)酶切和連接一起的

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6樓2012-03-12 13:27:23

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jting0912

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應(yīng)該先各自進(jìn)行酶切，驗(yàn)證酶切成功后再連接吧~~~~~~~~~~~~~

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3樓2012-03-12 11:08:47

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susizheng

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內(nèi)切酶切完后，體系滅活，再用加連接酶連接吧，buffer可以共用，但是加連接酶時(shí)要額外加ATP提供能量。

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4樓2012-03-12 11:17:55

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holygoof

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7樓2012-03-12 15:38:42

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樓: Originally posted by susizheng at 2012-03-12 11:17:55:
內(nèi)切酶切完后，體系滅活，再用加連接酶連接吧，buffer可以共用，但是加連接酶時(shí)要額外加ATP提供能量。

buffer可以共用嗎？我看文獻(xiàn)里面兩個(gè)酶是同時(shí)加的，而且只加了連接酶的buffer，沒有加內(nèi)切酶的buffer，但是我就做不出來，現(xiàn)在考慮buffer的問題，兩個(gè)buffer共用不會(huì)使溶液中鹽離子濃度升高嗎？不會(huì)影響酶的活性嗎?

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8樓2012-03-12 21:29:04

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susizheng

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8樓: Originally posted by 865310007 at 2012-03-12 21:29:04:
buffer可以共用嗎？我看文獻(xiàn)里面兩個(gè)酶是同時(shí)加的，而且只加了連接酶的buffer，沒有加內(nèi)切酶的buffer，但是我就做不出來，現(xiàn)在考慮buffer的問題，兩個(gè)buffer共用不會(huì)使溶液中鹽離子濃度升高嗎？不會(huì)影響酶的活性嗎?

我們做連接的時(shí)候，載體酶切一般都不回收，直接將載體酶切體系加酶切回收片段連接，加連接酶加ATP，不再加連接酶的buffer，因?yàn)殡x子濃度太高對(duì)酶活影響較大。

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9樓2012-03-12 21:41:58

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引用回帖:

樓: Originally posted by susizheng at 2012-03-12 21:41:58:
我們做連接的時(shí)候，載體酶切一般都不回收，直接將載體酶切體系加酶切回收片段連接，加連接酶加ATP，不再加連接酶的buffer，因?yàn)殡x子濃度太高對(duì)酶活影響較大。

我的體系是先鏈接，然后酶切。
我加的1倍的連接酶buffer，內(nèi)切酶的buffer就不知道該怎么加了，試過不加內(nèi)切酶buffer、0.5倍內(nèi)切酶buffer和1倍內(nèi)切酶buffer，感覺現(xiàn)象很亂，應(yīng)該是內(nèi)切酶沒起作用，不知道是不是buffer的原因，感覺總這么試buffer的量也挺浪費(fèi)時(shí)間的

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10樓2012-03-13 11:28:49

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

我也想做這個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)問你做成了沒？還有你看的是哪篇文獻(xiàn)，能否告知，謝謝！

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11樓2014-04-22 23:38:57

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