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[求助]
求助蛋白純化的高手
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| 我現(xiàn)在真核表達(dá)一個(gè)蛋白，蛋白分泌到培養(yǎng)基的上清中，準(zhǔn)備用DMEM培養(yǎng)，2%FBS.目的蛋白的分子量是22KD，等電點(diǎn)是9.2，有沒有高手能幫我設(shè)計(jì)一個(gè)純化的步驟呀！該蛋白沒有標(biāo)簽，想直接用親和層析，用該蛋白的抗體制備能行嗎？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+3): Good！ 2012-03-14 22:20:55
yuanalice: 金幣+15, ★★★很有幫助 2012-03-15 10:48:05
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（1）加入NaOH溶液調(diào)pH值到9-10 （2）4度8000轉(zhuǎn)離心約10分鐘，取上清： （3）按照1比7的比例加入4M NaAc溶液，利用HAc調(diào)pH值至4.5-5.0 4M NaAc溶液： 分子量 質(zhì)量 總體積 4M NaAc 82.07 65.61g 200mL （用HAc調(diào)pH值至4.5，先用少量的水（約50mL）溶解NaAc,然后加入HAc至pH5.3左右，稀釋10測(cè)定pH值（取0.5mL溶液加水稀釋至5mL測(cè)定pH值，）用HAc調(diào)節(jié)原NaAc溶液使得稀釋10后的溶液pH值至4.5） （4）4℃下，沉淀6-8h （沉淀時(shí)間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排適當(dāng)調(diào)整至更長，不可低于6h） （5）4℃下，12000rpm離心15min，收集沉淀 （6）用預(yù)冷無菌水洗滌沉淀2次，4℃下，12000rpm離心15min （7）沉淀溶于50 mM的Na2CO3溶解，1M NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.5-10.0 （注意: 加入體積為1L菌液溶于10mL Na2CO3溶液。若晶體蛋白降解可加入150 mM的PMSF）。 |
2樓2012-03-14 20:07:59
lihuan0525
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜: 金幣+3, Good! 2012-03-28 10:11:42
yuanalice: 金幣+3 2012-04-09 10:26:14
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西瓜: 金幣+3, Good! 2012-03-28 10:11:42
yuanalice: 金幣+3 2012-04-09 10:26:14
| 建議首先將上清液用30 kDa截留的膜濃縮，目的蛋白的分子量是22 kDa，進(jìn)入外液而FBS因分子量較大在內(nèi)液。接下來，將外液用10 kDa截留的膜濃縮。這時(shí)，目的蛋白在內(nèi)液，而小分子量物質(zhì)被排出到外液。將濃縮的內(nèi)液過凝膠過濾，應(yīng)可得到較高純度的目的蛋白，而且生物活性不會(huì)有太大損失。 |
6樓2012-03-27 22:07:07
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