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dingfang0707金蟲 (正式寫手)
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[求助]
前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)
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我最近在體外培養(yǎng)鴨前體脂肪細(xì)胞，但每次看到的細(xì)胞量都非常少，即使傳代后也是零零散散那么幾個(gè)細(xì)胞，少得可憐。請高手指點(diǎn)一下。謝謝 PS：每次取樣：孵化后1周齡的小鴨子5只左右，腿部、腹部脂肪細(xì)胞。 |
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)，很熱心哦 2012-04-09 14:22:52
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)，很熱心哦 2012-04-09 14:22:52
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感興趣，查了下，結(jié)果是小鼠的，僅供參考： 正常小鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)材料： 1. 細(xì)胞來源：8—12天齡的小鼠； 2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1&time，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4； 3. 消化液：0.3%膠原酶溶液，含4%牛血清 白蛋白。用Hanks液配制； 4. DW培養(yǎng)液：DMEM和WAJC404培養(yǎng)液按1：1（V/V）混合，添加100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素； 5. 培養(yǎng)液a：DW培養(yǎng)液，10%胎牛血清 ； 6. 培養(yǎng)液b：DW培養(yǎng)液，補(bǔ)充胰島素10μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml、成纖維細(xì)胞生長因子 （FGF）10ng/ml和高密度脂蛋白（HDL）溶液5μl/ml； 7. 高密度脂蛋白（HDL）溶液：含蛋白質(zhì)18mg/ml和膽固醇10mg/ml； 8. 地塞米松：工作濃度為10-7mol/L； 9. 篩網(wǎng)：孔徑分別為250μm與80μm的尼龍網(wǎng)篩； 實(shí)驗(yàn)方法： 1. 取材； 1） 取8—12天齡的小鼠，窒息處死后，置于冰塊上； 2） 在無菌條件下迅速切取腹股溝的脂肪墊，放入液中； 3） 清除脂肪墊中的大血管和結(jié)締組織，洗凈血污。稱取脂肪墊的重量； 2. 分離細(xì)胞； 1） 將脂肪墊剪成1mm3左右的小塊，轉(zhuǎn)入50ml錐形離心管 中； 2） 每0.1g組織塊加入3—4ml消化液。在37℃水浴 搖床 上以60r/min的轉(zhuǎn)速輕微振蕩，消化1h。其間每隔10min取出離心管 ，搖動(dòng)，使組織塊與消化液充分混勻； 3） 消化完后，用吸管 反復(fù)吹打消化液，分散組織塊，制成細(xì)胞懸液； 4） 用孔徑為250μm的尼龍網(wǎng)篩過濾細(xì)胞懸液，除去未分散的組織塊，收集濾液。將濾過液再用孔徑為80μm的尼龍網(wǎng)篩過濾，除去大部分成熟脂肪細(xì)胞，收集濾液； 5） 將最后得到的濾液離心（700g，7—10min）。吸棄漂浮的脂肪細(xì)胞和消化液； 6） 用培養(yǎng)液a清洗細(xì)胞，離心（700g，7min）。將細(xì)胞團(tuán)制成懸液，再離心。最后，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液a重新制成細(xì)胞懸液； 3. 原代培養(yǎng)； 1） 用培養(yǎng)液a調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。將細(xì)胞以1.5&time104個(gè)/cm2的密度接種于培養(yǎng)板中； 2） 24h后，用DW培養(yǎng)液徹底清洗細(xì)胞，除去培養(yǎng)物中殘留的胎牛血清和未貼壁的細(xì)胞（主要為紅細(xì)胞）； 3） 換入培養(yǎng)液b，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后用培養(yǎng)液b維持培養(yǎng)。每3d換液一次； 4） 在細(xì)胞匯合成片后，繼續(xù)培養(yǎng)；或于細(xì)胞匯合成片后第五天，在培養(yǎng)液b中加入10-7mol/L地塞米松，繼續(xù)培養(yǎng)； 5） 培養(yǎng)至出現(xiàn)漂浮細(xì)胞時(shí)，即可收貨細(xì)胞，進(jìn)行鑒定 |
3樓2012-04-09 10:29:31
4樓2012-04-09 10:31:01
dingfang0707
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 1570.1
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- 蟲號: 1177271
- 注冊: 2010-12-25
- 性別: MM
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
5樓2012-04-10 08:49:52
dingfang0707
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6樓2012-04-10 08:50:22
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