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firsky金蟲 (小有名氣)
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[求助]
巢式PCR
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同學(xué)在做土壤細(xì)菌多樣性的檢測，進(jìn)行巢式PCR。剛開始做的時候直接把引物稀釋到100μM，50μL體系加1μL，做出來結(jié)果雖然電泳有雜帶，但主帶很清晰。后來把引物稀釋到10μM，第一輪PCR（目的片段1500bp左右）電泳圖顯示主帶比較亮，繼續(xù)進(jìn)行第二輪PCR(目的片段200bp左右)，就只能隱隱約約出來彌散條帶。 請教一下可能的原因及解決方法。 上圖： 第一輪PCR的電泳圖，Marker 2μL,產(chǎn)物5μL。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，加了1μL。 第二輪PCR的電泳圖，加樣量第一輪。后來又用第一輪PCR產(chǎn)物做了第二輪PCR，條帶稍微亮一些了，但還是彌散狀。 |
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sarah_lz
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firsky: 金幣+3, ★有幫助, 多謝，現(xiàn)在已經(jīng)驗證出是第二輪的引物降解的問題 2012-04-16 20:25:45
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首先，nestpcr最關(guān)鍵是引物 第一輪1500base的產(chǎn)物估計不包含你的目的片段，第一輪看不到條帶的 建議用blast檢查一下引物區(qū)域的特異性，建議重新設(shè)計引物，兩次長度不用相差那么大 其次，第二輪pcr底物濃度太高 第一輪電泳看不到條帶的情況下大概+0.1uL為底物 |
2樓2012-04-16 12:05:43
chibang1220
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3樓2012-04-16 12:52:47
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5樓2012-04-16 13:59:40
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6樓2012-04-17 08:13:11
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| 第一輪片段的特異性很重要吧，我最近也遇到類似問題，第一輪PCR產(chǎn)物不是很好，會嚴(yán)重影響到后續(xù)實驗，我的還在摸索條件，我能給你的建議是：1、將第一輪PCR產(chǎn)物切膠回收，以去掉那些非特異性片段；2、第二輪PCR時，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后再作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，引物少加點，引物濃度一般是10μM, 25 μL體系中可嘗試只加0.35μL引物。 |
7樓2012-04-19 10:39:16
8樓2013-05-16 20:08:34
9樓2013-05-16 20:09:19
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10樓2013-05-17 08:31:42
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