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sunwei57

木蟲 (小有名氣)

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連接428bp大小的片段不用高保真的酶,隨便一個(gè)酶就可以,使用TAKARA的PMD19-T載體稀釋10倍取1微升,片斷4微升反應(yīng)時(shí)間是16℃過(guò)夜

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11樓2012-04-18 09:44:26

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gjs713

至尊木蟲 (職業(yè)作家)

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片段濃度太低吧
還有T載體加的太多，像你這里加0.1的T載就夠

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勤奮、執(zhí)著、專注，則無(wú)堅(jiān)不破。

12樓2012-04-18 10:52:15

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送鮮花一朵

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11樓: Originally posted by sunwei57 at 2012-04-18 09:44:26:
連接428bp大小的片段不用高保真的酶,隨便一個(gè)酶就可以,使用TAKARA的PMD19-T載體稀釋10倍取1微升,片斷4微升反應(yīng)時(shí)間是16℃過(guò)夜

好的。我去試試看。

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13樓2012-04-18 19:12:08

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12樓: Originally posted by gjs713 at 2012-04-18 10:52:15:
片段濃度太低吧
還有T載體加的太多，像你這里加0.1的T載就夠

恩。我會(huì)去試試看的。

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14樓2012-04-18 19:12:30

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10樓: Originally posted by honinglee at 2012-04-17 16:58:40:
對(duì)還糾結(jié)于T-載連接這種小問(wèn)題的童鞋我深表同情，曾經(jīng)的我浪費(fèi)了大量的時(shí)間在載體構(gòu)建上，現(xiàn)在想想這些逝去的時(shí)間都痛心，幾年過(guò)去了，現(xiàn)在好多帶致死基因的PCR克隆載體十分好用，別再用那些藍(lán)白篩選的載體了，耗 ...

哎。。。老師為了節(jié)約成本。感受態(tài)也是自制的。。。以后工作了可能好點(diǎn)。

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15樓2012-04-18 19:15:53

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123gyf002

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助，今天很活躍哦 2012-04-19 13:49:43

Taq沒(méi)擴(kuò)增不出來(lái)，只有兩種可能：引物不行和模板質(zhì)量不行；你的情況應(yīng)該是模板質(zhì)量不行（其它酶能擴(kuò)出來(lái)），模板稀釋10倍再用，還不行的話，從頭提模板吧

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16樓2012-04-18 22:08:35

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syn1985

木蟲 (正式寫手)

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-04-19 13:49:53

片段濃度不用測(cè) 只要你在回收前看取5ul上樣條帶亮就肯定能連上如果你必須要你那個(gè)酶擴(kuò)增的話我建議你一次多做幾管先用DNA產(chǎn)物回收盒回收產(chǎn)物然后再加A 然后切膠回收我一直這么做從沒(méi)有問(wèn)題祝好運(yùn)

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17樓2012-04-19 12:45:14

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yanhua_2006

鐵桿木蟲 (著名寫手)

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直接用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后切膠回收直接用來(lái)進(jìn)行T載體連接，pMD19載體我用過(guò)，16℃連接過(guò)夜，時(shí)間稍微長(zhǎng)一點(diǎn)兒，應(yīng)該沒(méi)有什么問(wèn)題的。我覺(jué)得可能連接時(shí)間有點(diǎn)短。

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18樓2012-04-20 09:49:03

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王雨云

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感覺(jué)樓主連接時(shí)間確實(shí)有點(diǎn)短，一般都是16度過(guò)夜連接

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19樓2012-04-20 17:01:35

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xjtu0025

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照例說(shuō)400多片段,taq酶應(yīng)該是毫無(wú)壓力呀..你是不是taq酶失火了...

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20樓2013-05-20 08:52:36

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