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wcx蝸牛無蟲 (小有名氣)
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[求助]
RT-PCR求助
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本人近期做RT-PCR克隆基因，開始用p出來，可是目的條帶很淡，后來優(yōu)化體系，結(jié)果不但p不出來，還有很嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象（之前一直是形成引物二聚體），陰性對照也是如此。再返回到最初體系也p不出來了。 引物二聚體好理解因?yàn)樽霰磉_(dá)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物沒辦法只能這樣，設(shè)計(jì)時(shí)提示引物二聚體就很多。可現(xiàn)在怎么p不出來，還拖尾這么嚴(yán)重。 pcr體系： 25ul pcr體系為: 水18ul、 10*buffer 2.5ul、 dNTPs 1ul、（10mM/each） 上下游引物各1ul（濃度10uM），后減為0.5ul 模板1ul(濃度200~300ng/ul左右)后減為0.5ul 酶pfu0.5ul（5U/ul） Pcr反應(yīng)條件為：設(shè)置梯度延伸3min，后延長為4min。目的基因長度1800bp。 左邊6孔為克隆目的基因，右邊兩孔為加水的陰性對照。 a最初pcr圖：左邊8孔為p我的目的基因，其中左1-4為pfu酶的，左5-8為taq酶的 DMSO,甘油，Mg都試過p不出我的目的基因，后來就出現(xiàn)如上圖所示的拖尾現(xiàn)象了，請教各位高人，拖尾怎么解決，我可以怎么優(yōu)化。 [ Last edited by wcx蝸牛 on 2012-5-3 at 11:26 ] |
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wcx蝸牛
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3樓2012-05-03 18:53:20
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| 你的這種情況我也碰見過，Pfu酶擴(kuò)增的效果不如TAQ酶，如果TAQ酶能擴(kuò)增，個(gè)人建議還是用TAQ酶擴(kuò)增好些。你的片段1800，一般我會延伸10min。另外你做多少個(gè)循環(huán),回到你最初的反應(yīng)體系和程序，用梯度PCR儀做個(gè)梯度擴(kuò)增，如果得到了目的片段，即使很不清楚，膠回收二次PCR，個(gè)人的一些經(jīng)驗(yàn)。 |
2樓2012-05-03 18:03:31
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| 所有的試劑、體系都按之前能P出來的條件，一個(gè)用普通的你原來用的PCR儀，另一個(gè)用梯度PCR儀，在你原來退火溫度上下加減5度，看看能不能P出來。我以前也是按原來的體系、條件發(fā)現(xiàn)P不出來，就是用梯度重新摸索的。體系中任何一個(gè)試劑的改變都可能有影響，試試看吧，祝你好運(yùn) |
4樓2012-05-04 14:15:12
liangxiuyan
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5樓2012-05-04 14:49:31
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