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（侯氏出品）雙酶切連接反應之全攻略
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雙酶切連接反應之全攻略（此內容系轉載，感謝作者） 前一陣子一直在做雙酶切質粒重組，失敗了 很多次，不過很快改善了 實驗方法，用2周重組了 14個質粒�，F(xiàn)就自己的體會，結合丁香園戰(zhàn)友的寶貴經驗，談一下質粒重組的一些個人經驗。 1、回收PCR產物：在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后，在各個酶的兩邊加上保護堿基，其原則可參照：http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 雙酶切時間及其體系：需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實完全沒有必要，我一般酶切3個小時，其實1個小時已經足夠。應用大體系，如100微升。 純化問題：純化PCR產物割膠還是柱式，我推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率�，F(xiàn)在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。我用的是TAKARA的純化柱試劑盒 酶量的問題：以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50 μl 反應液中，30℃溫度下反應1小時，將1 μg 的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15μg的DNA，而一般從1-4ml菌液提出的 DNA約為3μg，而PCR純化后的產物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的 質量好，酶切完全切得動。 2、酶切、回收后的PCR產物與載體的連接 摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。但對于初學者從頭認真計算則 非常有必要�；厥盏妮d體片段：回收的PCR產物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol為單位的DNA轉換為為µg單位的DNA：（X pmoles×長度bp×650）/ 1,000,000 （注：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數值即為µg,也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如載體是5380bp，則0.03pmol為 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。 測DNA濃度可以在專用機子上測，注意OD值，一般約1.8-2.0.另外，如果嫌麻煩，也可用MARKER進行估測，如MARKER2000，5微升的 MARKER每個條帶約50ng。 連接反應：TAKARA的 連接酶上的 說明寫的過夜，而其對連接酶單位的定義為：在20 μl的連接反應體系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反應30分鐘時，有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。而它的濃度為350 U/μl ，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時間3個小時足已。 3、轉化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。 b、42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。 c、加入890 μl AMP陰性培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。 取100μl鋪板。也可離心后余100μl 幾個非常重要的問題 1 做轉化的時候,進行酶連接反應時,注意保持低溫狀態(tài),因為LIGASE酶很容易降解.為保險起見,一般連接3小時,16度. 2 對含有AMP-RESISTENCE的質粒鋪板時,注意加AMP時的溫度,溫度過高,會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里，烤箱一般溫度為55-60度，然后做的時候拿出來，這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風機吹干 3對照的設立： 為驗證雙酶切是否成功,可做如下對照: A 酶切反應時加各單酶分別切,兩管,用同一種BUFFER,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功. 做轉化時,也要進行對照. 設4個: A.即拿雙酶切的質粒產物也進行連接反應,這個對照可進一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當然要保證感受態(tài),培基,連接酶都'正常'的情況下. B.酶切過的未進行連接反應的雙酶切產物,進行轉化,這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒 C.設原始質粒為對照,意為檢測整個操作過程中是否有誤. D.AMP陰性板上用同一批感受態(tài)細胞鋪板20微升足夠,檢測感受態(tài)狀況. 4.所有的試劑切記低溫保存.一步一個腳印.不要偷懶,圖省事最后卻更費事.注意設立對照。 經PCR鑒定，克隆90%-100%的陽性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑選4個就足夠了。然后雙酶切鑒定，測序。。。。。。 連接前最好將水、插入片段和載體混合好以后置于45度水浴5min，馬上置于冰上冷卻，再加入buffer和ligase。 就上面的對照簡要說一下我的結果。轉化后第二天可見14個標本的平皿上長了很多克隆，約100個左右，我用的是直徑6cm的板子，所以仍顯較多，（我是先挑半個克隆并標記好行PCR鑒定后再對另外的一半進行搖菌抽提質粒），較難挑克隆，所以鋪皿時不用離心，直接用100微升的鋪皿就可以了，我其中一個是這樣做的，長得克隆較大，很好挑選。 下面簡要的說一下對照的結果。 A 只長出了3個克隆，以100的基數計算，約為3%。即雙酶切反應中質粒只有3%進行了單酶切 B 約有5個克隆，即質粒完全沒被切動的約5% C 長了很多克隆，證明操作系統(tǒng)沒有問題。為系統(tǒng)控制指標。 D 長了很多克隆，證明感受態(tài)沒有問題。 這些對照相輔相成，揚長避短。萬一什么都沒作出來，也好分析原因。 JM108感受態(tài)細胞的制備 剛開始做實驗時，是向TAKARA購買的，一支30元，定了10支。后來干脆自己做，感覺質量和TAKARA的質量不相上下，下面談談我制作感受態(tài)的體會。 前期工作 分子生物耗費時間在于準備過程太多。所以做好前期工作非常重要，所謂‘磨刀不誤砍材功’。 注意事項 1.不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種劃板（AMP陰性）37度過夜培養(yǎng)，劃板時用小TIP頭挑少許冰渣即可，輕劃S行。同時記得設立對照：A 、在AMP陽性板劃菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，實驗室很多材料從師姐傳師妹，或許經過很多人的轉手。所以從頭鑒定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP陰性空白培基。系統(tǒng)控制參照，為更準確起見，用TIP頭不沾任何東西進行劃板。第二天挑克隆。 2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。 不過我一般鏈接反應后（TAKARA的鏈接酶，體系25微升）會全量加到200微升的感受態(tài)里，約為150ng（載體0.1微克，目的片段約0.05微克）。效果也好。 3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。國產的當然也可以。我用都是國產的，好像是隴西化學制劑，分析純。 4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 培養(yǎng)基的配制 1.配制LB-AMP抗性培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g， 氯化鈉l0g，加去離子水800ml充分攪拌溶解，用1mol/LNaOH調pH7.0，補加去離子水至1000毫升，高壓滅菌，4度保存。我一般沒有用1mol/LNaOH調pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g， 氯化鈉l0g加去離子水至1000ml。 2.LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂粉,高壓滅菌消毒； 3.Amp母液：用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml即100 ug/ul溶液,置-20℃保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀釋即得。然后分5支分裝(濃度100mg/ml即100 ug/ul)。 4.含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB液體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為100ug/ml搖勻后鋪板（30ml/90mm）：即多少毫升培養(yǎng)基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或減半量則最終濃度為50ug/ml 有指南上寫細菌轉化后37度復蘇時用SOC培基。我從來只用AMP陰性的普通培基，效果也很好。 5.0.05mol/L CaCl2溶液:我們實驗室只有CaCl2-6H2O，分子量219，配制100ml的，則需稱量0.005×219=1.095g就可以了。其實氯化鈣的摩爾濃度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 先配制成0.1mol/L的氯化鈣溶液50ml，加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。有文獻說要用0.22的濾器，其實完全沒有必要。高壓即可。 準備工作做好了，就可以開工了。 一、 受體菌的培養(yǎng) 從LB平板上挑取新活化的JM109單菌落,接種于3-10ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右（一般過夜）。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于10ml試管（如較多制備，多用幾個試管即可）的LB液體（AMP陰性）培養(yǎng)基中同時做空的培基對照,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 ＝0.5左右。 二、 感受態(tài)細胞的制備 ( CaCl2 法) 1、將培養(yǎng)液分轉入1.5ml的離心管中（一管10ml菌液可分裝成約6管1.5ml的離心管中）,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。 2、棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液200微升輕輕懸浮細胞,冰上放置30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。 3、棄去上清,加入200微升預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。 4、貯存于-70℃可保存半年。 要點：1.懸浮細胞時動作一定要輕柔；2 冰上。掌握者兩點可謂掌握了制備感受態(tài)的精髓，無往不利。 1 藍白斑篩選 藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。 X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。 在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。 所以猜測在4度冰箱中放置一段時間，藍斑會更藍可能與下面因素有關：半乳糖苷酶在低溫時表達增強，從而使X-Gal水解增多，產生更多的吲哚衍生物。（是否與低溫狀態(tài)下IPTG的誘導能力增強？） 相關文獻：allow time for better expression of the β-galactosidase enzyme 似乎沒有更多的證據或實驗資料。冒昧揣測。 2 我所用T載體是從公司購買。用于雙酶切的真核表達載體兩酶切位點只相隔20多BP，所以雙酶切后直接進行用DNA純化試劑盒即可。[ 來自科研家族 神之領域 ] [ Last edited by rr6666ugh on 2012-5-16 at 14:49 ] |
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2012-05-15 14:13:10, 43.5 K
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