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懶蛋鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
求助，求助，分子基礎(chǔ)知識
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問一些比較低級的問題，部分是胡思亂想的。 情況：外源基因?qū)敫惺軕B(tài)細(xì)胞，最簡單常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，不用基因槍啥的直接打進(jìn)去。 1）外源基因和載體鏈接，轉(zhuǎn)化Ecoli。為什么非要鏈接載體？線性的DNA就不能進(jìn)去了？即使鏈接到載體上，suoper coiled DNA vector也不是要解鏈變成線性單鏈DNA后才進(jìn)入細(xì)胞，另一條留在胞外不是？何苦跟載體連接成那么大的鏈才進(jìn)去？ 2）以下四種DNA哪個更容易進(jìn)入細(xì)胞？雙鏈環(huán)狀，單鏈環(huán)狀，雙鏈線性，單鏈線性. 轉(zhuǎn)化前，ligation之后的DNA 不知道能不能按以上狀態(tài)存在，就當(dāng)是假設(shè)也行。 3）雙鏈環(huán)狀超螺旋DNA進(jìn)入細(xì)胞之前據(jù)說要解鏈變成單鏈線性（網(wǎng)上查的,不知對錯），那究竟在什么位點切割成線性？所有質(zhì)粒都在同一位點么？ 4）有沒有以下可能：外源基因和載體沒有連上，但而這都被轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞了？或者只有其中一個轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞了？還表達(dá)了如抗性基，lacZ基因等情況？ 5）有沒有另一種可能：外源基因與載體一端連接成功，另一端未連上，但卻轉(zhuǎn)入細(xì)胞了，還表達(dá)了各種篩選基因，因而假裝陽性克隆濫竽充數(shù)的？ 6）線性質(zhì)粒就不能在細(xì)胞中正常存在，復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，遺傳嗎？非要呈環(huán)狀嗎？ 多謝各位哈~~~盡量給個完整的答案吧，回答部分問題也行，但是我確實想整明白。 50分期，有答必有幣~~~追賞！  |
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懶蛋
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
懶蛋: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 自然辯證法學(xué)的非常好！謝謝回復(fù)~~~學(xué)習(xí)了。 2012-05-17 13:57:26
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-05-17 14:43:52
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-05-17 14:43:52
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簡單的談?wù)勎业目捶ǎ缬绣e誤，歡迎指正： 1：直接的線性目的基因，本身不能在菌體內(nèi)表達(dá)，基因的表達(dá)是需要很多組件的，核糖體結(jié)合位點等組件；線性的載體也是可以進(jìn)到載體中并表達(dá)的，如T載體；而且，載體能提供諸如抗性標(biāo)記、純化標(biāo)簽、條件誘導(dǎo)等組分，所以說線性還是環(huán)形不是表達(dá)與否的重點，而是其組成上是不是滿足表達(dá)要求。 2：轉(zhuǎn)化本身就是使得細(xì)菌細(xì)胞壁的強度變?nèi)酰@樣質(zhì)粒才能進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，由此可見，體積較小的形態(tài)更容易進(jìn)入；一般來說，質(zhì)粒的形態(tài)有超螺旋、線性、開環(huán)，你說的單鏈環(huán)狀是不存在的，不符合質(zhì)粒特征；連接之后的質(zhì)粒有可能是上述三種形態(tài)。 3：轉(zhuǎn)化時進(jìn)入的是線性質(zhì)粒的說法我也聽過，可能是因為超螺旋形態(tài)體積較大不易進(jìn)入，只有線性容易進(jìn)入造成的，而且呈線性不是切割造成的，應(yīng)該是機械斷裂，三種形態(tài)在不同的溶劑中含量也是不同的，這也影響了轉(zhuǎn)化的效率。 4：兩者沒連接上，但是同時轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)部也是可能的，但是，一般來說，目的基因會被迅速水解掉，質(zhì)粒倒是有可能重新連接，不過總的來說，表達(dá)抗性或目的基因的概率不大。 5：與4相似 6：線性質(zhì)粒也是可以在細(xì)胞中正常存在，復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，遺傳的，不一定非得是環(huán)形，如T載體等。 沒經(jīng)過修飾和處理的線性基因在細(xì)菌體內(nèi)都是不能穩(wěn)定存在的。 |
6樓2012-05-17 12:03:51
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7樓2012-05-17 12:33:31
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9樓2012-05-18 16:43:18
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