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關(guān)于親和色譜，你真正了解多少？ 已有6人參與
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此文是某書的節(jié)選，我放在這，旨在提高大家對親和層析缺陷的認(rèn)識，歡迎大家討論交流。 親和色譜被認(rèn)為是理想的色譜法，它具有特異性高，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)；通過加樣、預(yù)洗、洗脫純化產(chǎn)物。高特異性和簡便性的代價(jià)往往很高，但這并不是指介質(zhì)本身的價(jià)格。親和色譜含有很多復(fù)雜的因素，在純化過程中具有極為重要的作用，如果忽視了這些復(fù)雜因素，付出的代價(jià)會(huì)更高。 1.產(chǎn)物變性 產(chǎn)物變性是親和色譜法最嚴(yán)重且長期存在的問題之一。這種現(xiàn)象在配體親和力較強(qiáng)、需要苛刻的條件洗脫產(chǎn)物時(shí)尤其明顯。洗脫時(shí)常選擇低pH的條件，最典型的是pH2.5～3.0。研究表明蛋白質(zhì)暴露在這種條件下會(huì)發(fā)生永久性的構(gòu)象改變。正常情況下疏水殘基被隱藏在一級結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，但在洗脫條件下就暴露出來了，蛋白質(zhì)與柱子非特異疏水性結(jié)合相應(yīng)增加。此外，另一個(gè)后果就是蛋白質(zhì)發(fā)生聚合的概率上升，親和純化后用分子篩分離蛋白質(zhì)可以很容易地證明這一點(diǎn)。 構(gòu)象改變后還有一個(gè)常見但不十分明顯的現(xiàn)象：產(chǎn)物蛋白質(zhì)的水解率增加。蛋白質(zhì)水解程度輕而人們往往注意不到，但這個(gè)問題仍然廣泛存在。最隱蔽也最容易被忽視的問題是二級結(jié)構(gòu)效應(yīng)器的修飾現(xiàn)象。抗體就是一個(gè)很好的例子：抗體分子的非抗原結(jié)合區(qū)域含有大量與各種蛋白質(zhì)、糖類和免疫細(xì)胞結(jié)合的受體。受體發(fā)生構(gòu)象修飾后，其功能也會(huì)發(fā)生改變。所有這些提高增加蛋白質(zhì)的聚合性、裂解性和改變效應(yīng)器功能的因素都可以 （可能）引起改變產(chǎn)物的有效性、安全性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的變化，甚至改變蛋白質(zhì)的治療功能。因此應(yīng)該在選擇洗脫條件時(shí)考慮到以上因素。 解決上述問題的方法之一是選擇較溫和的洗脫條件。第一個(gè)反對此方法的意見是： “如果用較溫和的pH，洗脫的效率就會(huì)降低。”實(shí)際上適當(dāng)?shù)纳遬H也可以可能完全不影響洗脫效率，當(dāng)然這樣需要投入精力尋找有效的pH的范圍。如果只改變pH而不影響產(chǎn)率，就有很多機(jī)會(huì)了。生物親和性是由疏水作用力、電荷作用、氫鍵和其他機(jī)制復(fù)合作用而介導(dǎo)的，十分復(fù)雜。低pH可以扭曲蛋白質(zhì)分子，使之變形而無法與配體結(jié)合，除此之外還可以利用一個(gè)或多個(gè)其他作用機(jī)制來洗脫。當(dāng)然只靠這些無法構(gòu)成有效的洗脫，但卻可以改善洗脫蛋白質(zhì)所需的苛刻pH條件。例如50％的乙烯乙二醇能夠降低疏水作用。這個(gè)濃度下的乙烯乙二醇對于大部分蛋白質(zhì)都是穩(wěn)定的，同時(shí)蛋白質(zhì)的極性也能大幅度非常有效地降低蛋白質(zhì)的極性。乙烯乙二醇為非離子性分子，對下游的電荷純化方法也沒有影響。再如，1mol/L尿素可斷開氫鍵作用，這個(gè)濃度的尿素對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響極小，而且和乙烯乙二醇一樣，它也是非離子性的。0.5～1mol/L的尿素足以屏蔽一切電荷作用，且不會(huì)明顯增強(qiáng)疏水作用。也可以用相同濃度的促溶性鹽如高氯酸鈉代替尿素，促溶性鹽不僅僅能屏蔽電荷作用，它的促溶性還可以削弱電荷作用。 采取這些措施后可以提高洗脫液一個(gè)pH單位，一般來說這已經(jīng)足夠了。但是產(chǎn)生了一個(gè)不可避免的問題：采取上述措施會(huì)不會(huì)與單獨(dú)用pH洗脫一樣引起蛋白質(zhì)的變性？答案是不會(huì)。試想一下，如果你要將一塊釘在墻上的橡木板取下來移作他用，木板用螺絲釘擰緊在墻上，用釘子釘著，還用膠水粘著。如果只用一根撬棍想要完好無損地撬開木板的可能性很小，但若是先除去螺絲和釘子，再用熱水浸濕膠粘處，使之松動(dòng)，就可以輕松的取下木板，且損傷木板的可能性也減少了。但第二個(gè)障礙又產(chǎn)生了：這些操作抵消了親和色譜的簡便性。經(jīng)典的研究主要注重的是親和反應(yīng)機(jī)制，但是也需要通過實(shí)驗(yàn)來建立有效且變性率低的洗脫緩沖液。 盡管人們投入了很大力量建立不引起變性的洗脫緩沖液，但仍然會(huì)發(fā)現(xiàn)洗脫產(chǎn)物具有易于聚合和水解的傾向，或者一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)功能受到修飾的現(xiàn)象。事實(shí)就是這樣殘酷，變性在某種程度上是不可避免的。對親和反應(yīng)的研究一致表明，結(jié)合反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)伴隨出現(xiàn)一種被稱為誘導(dǎo)契合的現(xiàn)象。誘導(dǎo)契合是指當(dāng)反應(yīng)物相遇時(shí)，不僅親和配體，還有受體都會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，使兩個(gè)分子牢牢鎖住。誘導(dǎo)契合最好的證據(jù)之一是產(chǎn)物與配體可以在溫和的條件下結(jié)合，但想分開它們卻需要相當(dāng)嚴(yán)格的條件。有一個(gè)最好的例子如Protein A與IgG的結(jié)合，Protein A結(jié)合在Cg2和Cg3結(jié)構(gòu)域間的疏水裂隙內(nèi)，X射線晶體衍射數(shù)據(jù)顯示Cg3在分子接觸后不受影響，但Cg2結(jié)構(gòu)域向Protein A和Cg2縱向移動(dòng)。除了結(jié)合區(qū)域的構(gòu)象改變，結(jié)合反應(yīng)還使受體富集的末端第三Cg2結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，這會(huì)引起Cg2之間的糖結(jié)構(gòu)的局部旋轉(zhuǎn)和不穩(wěn)定，且這些影響是永久性的。不管如何小心選擇洗脫條件，純化后的產(chǎn)物與未經(jīng)親和色譜的對照物相比，蛋白質(zhì)的行為特征的改變總是可檢測到。但這并不意味著建立溫和的洗脫條件毫無意義，相反是非常有用的，只不過這些措施都不能完全避免蛋白質(zhì)的變性。 2.滲漏 親和色譜的第二個(gè)問題是生物親和配體和雜質(zhì)的滲漏。滲漏現(xiàn)象很隱蔽卻十分嚴(yán)重。正是由于滲漏現(xiàn)象，美國食品藥物管理局（FDA）要求用于生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的親和配體與生產(chǎn)的終產(chǎn)物使用相同的申請標(biāo)準(zhǔn)，甚至到控制親和配體的純化過程。例如常用于親和色譜的Protein A，由固定了人類單抗IgG的親和色譜純化。IgG色譜柱可能含有病毒，如果滲漏到純化的Protein A中，病毒就有可能進(jìn)入到純化終產(chǎn)物。即使徹底控制了病毒的污染，卻還有一個(gè)問題：Protein A來源于致病菌，有含有有害雜質(zhì)的危險(xiǎn)。有些色譜介質(zhì)生產(chǎn)廠家用重組的非致病菌專門生產(chǎn)Protein A來解決這個(gè)問題，并用非生物學(xué)方法純化Protein A。 如果自己制備單抗色譜柱來純化某個(gè)生物活性物質(zhì)，產(chǎn)生單抗的細(xì)胞系的致病性不是主要問題，而病毒污染卻是必須要處理的，也要仔細(xì)檢測終產(chǎn)物是否含有BSA、HCP、DNA、內(nèi)毒素等。 以上所討論的問題只是滲漏最簡單的一個(gè)方面。生物活性配體本身對產(chǎn)物安全性和有效性的影響似乎比那些與配體同時(shí)固定的雜質(zhì)更大。例如Protein A，有150多篇文獻(xiàn)描述了它能夠干擾現(xiàn)有的每一個(gè)免疫機(jī)制，這并不奇怪，如果不是這樣反倒更令人奇怪。親和配體對IgG（一個(gè)可以稱為自然免疫軸心的分子）的影響非常大。同樣其他親和配體也是如此。親和色譜的優(yōu)勢在于它能識別分子的某種特殊性質(zhì)，并將此分子從其他沒有這個(gè)性質(zhì)的分子中分離出來。但問題也隨之產(chǎn)生了：分子的這些特殊性質(zhì)往往與其某方面功能直接相關(guān)。以抗原和抗體為例，相關(guān)的功能可能是基礎(chǔ)的，如抗原結(jié)合功能；也可能是其他功能，如補(bǔ)體的固定。這就使得親和配體有極大可能會(huì)直接干擾產(chǎn)物的功能，或影響分子有效性，改變生物清除率以及其他藥物代謝動(dòng)力學(xué)的行為。 色譜介質(zhì)生產(chǎn)廠家已采取措施盡量減少滲漏，有些甚至宣布已經(jīng)研制出無滲漏的固定基質(zhì)，但似乎不太可能。親和基質(zhì)的破壞和固定聯(lián)合鍵的斷裂只是生物活性配體滲漏來源的一小部分。滲漏的主要來源是蛋白質(zhì)的酶切裂解。對于固定的抗體，常見的是Fab段或F(ab)′段斷裂，裂解酶主要來源于所加的樣品，如加樣流入的液體，或是抗體制備時(shí)帶有的。對于固定的Protein A，裂解變性嚴(yán)重且相當(dāng)廣泛，事實(shí)上目前也是無法控制的。這一點(diǎn)可以由配體的結(jié)構(gòu)了解到：Protein A由5個(gè)緊湊的柱狀的蛋白酶抗性的IgG結(jié)合域構(gòu)成，并由易于被蛋白酶裂解的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)連接。其他配體只出現(xiàn)特定斷裂形式，但Protein A的5個(gè)結(jié)構(gòu)全部可以斷裂，而且都會(huì)滲漏。 綜上可知，除去漏出物非常重要，但問題是漏出的配體是結(jié)合在產(chǎn)物上的。與最初親和柱俘獲產(chǎn)物蛋白質(zhì)一樣，只要緩沖液條件允許，漏出物會(huì)很快與純化產(chǎn)物再聚合。如果漏出物的分子特性與產(chǎn)物有較大區(qū)別，還有可能將漏出物與產(chǎn)物的復(fù)合物分離。例如，如果產(chǎn)物與陰離子交換劑結(jié)合差，而漏出物結(jié)合得很好，復(fù)合物與陰離子交換劑的結(jié)合能力就介于兩者之間，可以被選擇性地除去。一部分產(chǎn)物會(huì)因此而損失 （產(chǎn)物是與滲漏物結(jié)合的），但這種方法通常有效。不過更常見的是，復(fù)合物的特性允許除去一部分漏出物，可除去的量不夠。例如Protein A 比IgG的疏水性強(qiáng)，但只稍強(qiáng)一點(diǎn)。在疏水柱上洗脫產(chǎn)物―漏出物復(fù)合物的條件與洗脫產(chǎn)物的條件十分相似，要除去50％的漏出物可能會(huì)損失50％的產(chǎn)物。 更有效的方法是在漏出物與產(chǎn)物解離條件下分離兩者。例如，若有小片斷的漏出物與相對大分子的產(chǎn)物相結(jié)合，則可以在親和柱洗脫條件下用分子篩分離。這樣做的弊端是延長了產(chǎn)物在變性條件下的暴露時(shí)間。陽離子交換是一種很好的替代方法：在pH足夠低的條件下，大部分蛋白質(zhì)可以與陽離子交換劑結(jié)合，如已知漏出物與產(chǎn)物解離的pH即可。只要漏出物的洗脫性質(zhì)與產(chǎn)物有足夠的差別就可以把兩者分開。陽離子交換之所以優(yōu)于分子篩是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)合在陽離子交換劑上時(shí)，由于位阻限制，蛋白質(zhì)對構(gòu)象變異的抵抗能力高于相同條件下溶液中游離的蛋白質(zhì)。很多蛋白質(zhì)在低pH的溶液中迅速發(fā)生變性，但若陽離子柱結(jié)合后可以穩(wěn)定保持幾個(gè)小時(shí)，這些時(shí)間足夠除去漏出物。 如果由于某些原因不能大量除去漏出配體，仍然有必要計(jì)算漏出的量，并確認(rèn)對產(chǎn)物安全性和有效性無不利影響的配體含量的最大值。這一步也比表面上看起來要復(fù)雜得多。如果體系內(nèi)含有漏出配體，配體與產(chǎn)物相結(jié)合后，可能會(huì)占據(jù)抗原結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致無法根據(jù)抗原結(jié)合來準(zhǔn)確定量。這并不僅僅是理論上的假設(shè)，而是一個(gè)已證實(shí)的現(xiàn)象。為了得到精確的測量值，必須建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線——Protein A與IgG各型、各亞型的親和曲線。這意味著需要用與產(chǎn)物相同亞型的非Protein A純化的抗體來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的準(zhǔn)確性也受Protein A不同結(jié)構(gòu)域數(shù)量的構(gòu)象的影響，這一點(diǎn)相當(dāng)麻煩。為了準(zhǔn)確起見，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的Protein A的構(gòu)象必須與樣品相同。但直接了解樣品中Protein A的構(gòu)象幾乎沒有什么可行性，除此之外還有其他的復(fù)雜性。從實(shí)際操作的角度來看，惟有將漏出的Protein A徹底地分離出來，并根據(jù)純化Protein A的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照求得回收的量，準(zhǔn)確測量漏出量。 3.成本 親和色譜的其他缺點(diǎn)都很明了，但最明顯的是此方法成本昂貴。對于同樣的基質(zhì)，購買親和配體的價(jià)格要比離子交換劑貴7～15倍。如果自己制備親和介質(zhì)，直接的耗費(fèi)是降低了，但卻增加了研究的費(fèi)用，最終總耗費(fèi)很可能超過直接購買介質(zhì)的費(fèi)用。這會(huì)使整個(gè)純化過程的成本增加。有資料證明：一步親和純化單位量蛋白質(zhì)的成本要比兩步離子交換法純化高9倍。若產(chǎn)物在體內(nèi)使用，為了除去漏出物和其他雜質(zhì)還需額外的純化步驟，成本會(huì)更高。使用壽命逐漸降低是生物親和介質(zhì)的另一個(gè)局限性，同時(shí)也是一個(gè)增加成本的因素。大部分親和介質(zhì)不能耐受用非生物性物質(zhì)清洗和消毒的條件。即便可以耐受，也只能有限地循環(huán)使用幾次。很多親和介質(zhì)還會(huì)在進(jìn)料時(shí)發(fā)生生物變性，如上文提到的Protein A就十分容易被裂解，尤其是在正常加樣pH中性偏堿的條件下。雖然親和介質(zhì)最初制備和更換的費(fèi)用已經(jīng)相當(dāng)高，但這與隨產(chǎn)物變性和配體滲漏而來的檢測認(rèn)證費(fèi)用相比仍是微不足道的。 上述這些問題并不說明應(yīng)該盡量避免使用親和色譜，這只是提醒讀者在進(jìn)行表面上看似簡便的親和色譜時(shí)，仍要了解親和色譜對產(chǎn)物安全性和有效性的潛在影響，了解它需要技術(shù)上的研究——既要控制變性又要除去滲漏物，并考慮由以上因素引起的檢測費(fèi)用。總體而言，在純化過程中加入親和色譜操作，如果純化效果明顯優(yōu)于其他非親和方法，則它可作為候選方法之一。 [ Last edited by xiehe_ai on 2012-6-2 at 23:22 ] |
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