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qiulilf金蟲 (小有名氣)
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真菌DNA的提取
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真菌細(xì)胞DNA的提取: 菌種的培養(yǎng)與收集： 酵母菌在沙堡培養(yǎng)基上培養(yǎng)18~24h后，取1~2個(gè)菌落接種于6mL沙堡液體培養(yǎng)基中，室溫下190r/min振蕩培養(yǎng)48h. 3000×g離心10min,集菌，用無菌生理鹽水洗滌菌細(xì)胞2次。曲霉，鐮刀菌和青霉等在PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24h后， 轉(zhuǎn)至室溫下繼續(xù)培養(yǎng)2周， 用0.0125%吐溫20生理鹽水沖洗斜面以獲得菌細(xì)胞，3000×g離心10min,集菌，用無菌生理鹽水洗滌菌細(xì)胞2遍。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板將每一菌種濃度調(diào)至3.0×109菌細(xì)胞/mL,取4mL菌細(xì)胞懸浮液離心,棄上清夜,菌細(xì)胞沉淀層轉(zhuǎn)移至1.5mL已知質(zhì)量的EP管中,用電子天平稱其質(zhì)量,-20℃保存?zhèn)溆? 1.尿素裂解法:將保存的菌細(xì)胞懸于1mL尿素裂解液中(尿素8 mol/L,NaCl 0.5 mol/L,Tris 20 mmol/L,EDTA 20 mmol/L,2%SDS;PH:8.0),在室溫下孵育3h.DNA的提取參照<<分子科隆指南>>.另外將等量菌細(xì)胞沉淀置于1mL尿素裂解液中置室溫下24h,1個(gè)月,3個(gè)月,5個(gè)月,6個(gè)月,分別提取DNA 2.研磨+十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法:將菌細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至一高壓滅菌,預(yù)冷的研缽中,用液氮冷凍后,研磨成細(xì)末,移入EP管中.用1%CTAB提取液(1%CTAB,1.4mol/L NaCl,10mmol/LTris PH:8.0,20 mmol/LEDTA )600μL沖洗研缽和研棒,并重懸研磨的菌細(xì)胞,冰浴1h, DNA提取方法同上. 3.超聲裂解法:菌細(xì)胞沉淀用500μL裂解液重懸(0.5mol/L EDTA,1mol/L Tris-HCl, 0.3%SDS;PH 8.0)超聲處理30s,念珠菌,曲霉及青霉等處理2次,隱球菌處理4次,在處理期間,樣品置于冰上10min,DNA提取方法同上. [search]真菌DNA的提取[/search] |
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2樓2007-04-25 20:50:16
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