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抗血清的純化方法
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抗血清的純化 (Purification of antiserum) 抗血清純化的目的是盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分，以防止抗體外的其他血清成分對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此只能根據(jù)不同目的的要求，從抗血清中除去容易干擾的有關(guān)成分，或提取相應(yīng)的免疫球蛋白。 抗血清純化的方法主要有粗提法和精制法兩個(gè)過(guò)程。粗提法主要常用硫酸銨鹽析法，精制法分非特異性和特異性兩種類(lèi)型。非特異性方法如葡聚糖凝膠過(guò)濾法、離子交換層析法，其方法均系基于蛋白質(zhì)分子的物理性質(zhì)。特異性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗體的特異性反應(yīng)。 一、鹽析法 (Salt fractionation) 【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對(duì)溶解度不同，血清γ球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀，而白蛋白則不易沉淀，據(jù)此可將二者分離。 【主要試劑與器材】 1.飽和硫酸銨溶液 取500ml蒸餾水加熱至70～80℃，將400g硫酸銨溶于其中，攪拌20min，冷卻。待硫酸銨結(jié)晶沉于瓶底，其上清即為飽和硫酸銨。在使用前用28%氨水調(diào)pH7.0。 2.兔血清(含抗體)。 3.透析袋、離心機(jī)等。 【操作方法】 1.用55%飽和硫酸銨提取血清中β、γ球蛋白 ⑴血清1份加生理鹽水1份混勻,然后逐滴加入飽和硫酸銨2份中,邊加邊攪拌,防止形成團(tuán)塊降低沉淀物的特異性.混勻后靜置30min或置4℃冰箱過(guò)夜。 ⑵低溫高速10 000/min離心10min，將上清液(含白蛋白)棄去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理鹽水中。 2.用33%飽和硫酸銨提取γ球蛋白 將上述提取物生理鹽水溶液2份加1份飽和硫酸銨。然后再10 000/min離心，其余操作同上。 3.按同樣方法用33%飽和硫酸銨再提取1次。 4.將提取物裝入透析袋，在生理鹽水中透析，以除去其中所含的硫酸銨。放-20℃冰箱保存。 【結(jié)果判斷】 用雙向免疫擴(kuò)散法和免疫電泳法檢測(cè)抗體活性、效價(jià)和純度。 【注意事項(xiàng)】 1.用于鹽析的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鹽等，最常用的是硫酸銨，因?yàn)榱蛩徜@飽和溶液所含鹽濃度很高，溶解度受溫度影響小，一般不引起蛋白質(zhì)變性，但不純的硫酸銨含重金屬，會(huì)影響蛋白質(zhì)生物活性，故應(yīng)用分析純?cè)噭?br /> 2.中性鹽濃度 不同濃度硫酸銨，當(dāng)達(dá)到20%飽和度時(shí)，可沉淀血漿中纖維蛋白原，增加飽和度至28%～33%，可使優(yōu)球蛋白析出，當(dāng)飽和度大于50%則可析出白蛋白。 3.pH 當(dāng)溶液pH調(diào)至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，使所帶陽(yáng)電荷與陰電荷相等時(shí)，易使蛋白析出。球蛋白等電點(diǎn)為pH5～8。 4.蛋白質(zhì)濃度 如血清蛋白的濃度自0.5%遞增至3%時(shí)，所需中性鹽飽和度的最低極限度可從29%遞減至24%，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度增高后，蛋白質(zhì)的共沉作用也增加，影響蛋白質(zhì)純化，故當(dāng)溶液內(nèi)蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，可做適當(dāng)稀釋?zhuān)话阏J(rèn)為2.5%～3.0%的蛋白濃度較好。 5.溫度 鹽析蛋白時(shí)溫度要求并不嚴(yán)格，一般在室溫(25℃)比在0℃時(shí)更易析出，除非鹽析對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)(如抗體)要求在4℃進(jìn)行。 6.透析除鹽 透析液內(nèi)NH4+的檢測(cè)可用納氏試劑，如產(chǎn)生黃色沉淀證明NH4+的存在。 【應(yīng)用與評(píng)價(jià)】 經(jīng)鹽析法提取的蛋白質(zhì)為粗提的免疫球蛋白，若要獲得純化的免疫球蛋白，必須經(jīng)凝膠過(guò)濾或離子交換層析提純。 【思考題】 1.鹽析法粗提免疫球蛋白的原理是什么？ 2.鹽析法粗提免疫球蛋白有哪些注意事項(xiàng)？ 二、凝膠過(guò)濾法 (Gel filtration) 【實(shí)驗(yàn)原理】 利用具有分子篩效應(yīng)的多孔網(wǎng)狀凝膠做為介質(zhì)，可分離提純分子量不同的大分子物質(zhì)。在凝膠過(guò)濾過(guò)程中，分子量大的物質(zhì)因不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間空隙先流出凝膠柱外；分子量小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢而最后流出柱外，這樣就能將分子量不同的物質(zhì)分離。 【主要試劑與器材】 1.待提純樣品。 2.Sephadex G-200。 3.2.5×100mm層析柱。 4.洗脫液 0.01mol/L pH7.2～7.4PBS(含0.14mol/L NaCl)。 5.751紫外分光光度計(jì)。 【操作方法】 1.處理凝膠 將Sephadex G-200用蒸餾水竟充分膨脹后進(jìn)行浮選。 2.裝柱 在層析柱底部鋪加一層尼龍紗，然后將洗脫液和凝膠粒子沿插入柱底的玻璃棒緩緩傾注于層析柱內(nèi)。 3.加樣 在凝膠柱表面再加一層尼龍紗，沿管壁緩緩加入樣品，所加樣品體積不超過(guò)凝膠柱的10%。 4.洗脫 洗脫液洗脫，流速20ml/h。待樣品洗脫下來(lái)(用20%磺基水楊酸檢測(cè))即用試管分段收集。 5.檢測(cè) 在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定各管樣品的A280nm值。 【結(jié)果判斷】 以A280nm值為縱軸，收集管次序?yàn)闄M軸，繪出各洗脫峰，并分別收集各峰的洗脫液，再分別進(jìn)行蛋白質(zhì)定量與性質(zhì)和純度的鑒定。用已知標(biāo)準(zhǔn)抗體，采用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳法鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)和純度。 【注意事項(xiàng)】 1.膨脹凝膠時(shí)，需將凝膠干粉慢慢加入到盛有10倍水的燒杯內(nèi)，邊加邊用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，待被浸泡膨脹的凝膠粒沉下，傾去上層水份及內(nèi)含的細(xì)顆粒，換蒸餾水?dāng)?shù)次，浸泡過(guò)程攪動(dòng)要溫和輕慢，以免損壞凝膠顆粒，裝柱前一定要達(dá)到充分膨脹并換洗脫緩沖液(PBS)再平衡，換PBS 2～3次，待裝柱用。 2.一般常用的洗脫緩沖液pH和離子強(qiáng)度以能使樣品穩(wěn)定為原則。血清蛋白成分的分離純化，多采用pH6.9～8.0之間磷酸鹽緩沖液或pH8.0 Tris-HCl緩沖液。 3.樣品洗脫結(jié)束后，凝膠即已再生。依次裝柱可反復(fù)使用多次。凝膠懸液加防腐劑后于4℃冰箱內(nèi)可保存數(shù)月。 【應(yīng)用與評(píng)價(jià)】 凝膠過(guò)濾法廣泛應(yīng)用于生物高分子的蛋白質(zhì)、酶、核算等的分離和提純；凝膠過(guò)濾法還可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，需取已知分子量樣品作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照；血清中存在異常免疫球蛋白，經(jīng)凝膠過(guò)濾得到與正常人不同的峰形。 【思考題】 凝膠過(guò)濾法純化抗體的原理是什么？ 三、離子交換層析法 (Ion exchange chromatography) 【實(shí)驗(yàn)原理】 離子交換層析是從血清包括抗血清中分離純化IgG的重要方法。它是利用帶電離子的纖維素(如DEAE纖維素)，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，又因各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不盡相同，在一定pH條件下，所帶電荷量不等，與纖維素結(jié)合的能力有別。當(dāng)用pH7.4磷酸緩沖液(PB)洗脫時(shí)，人血清蛋白中IgG所帶電荷最少，與纖維素結(jié)合最差，故最先被洗脫下來(lái)，從而可達(dá)到分離純化目的。 【主要試劑與器材】 1.蒸餾水、0.5mol/L NaOH、0.01mol/L pH7.4 PBS、20%三氯醋酸。 2.混合正常人血清、DEAE纖維素。 3.層析柱、燒杯、pH試紙。 【操作方法】 1.用蒸餾水浸泡適量DEAE纖維素過(guò)夜，除去飄浮物，再用0.5mol/L NaOH浸泡30min，反復(fù)用蒸餾水洗，可用2 000r/min離心或布氏漏斗抽濾分離，直到洗至約pH7.4，用0.01mol/L pH7.4 PBS再洗一次后裝柱。 2.用相同的PBS平衡至pH7.4，當(dāng)柱上端的PB液凹面與纖維素相切時(shí)，加入一定量的血清，待血清滲入柱內(nèi)與柱面相切時(shí)，立即沿管壁加少量洗脫液至形成1cm液層后，用0.01mol/L PBS洗脫，控制流速為1ml/min。 3.分管收集,每管吸取少量洗脫液，加20%三氯醋酸測(cè)蛋白，合并、保留蛋白含量較高的洗脫液。 4.將含IgG的洗脫液裝入透析袋內(nèi)，用蔗糖或大分子聚乙二醇包埋過(guò)夜，水份析出，袋內(nèi)IgG被濃縮。IgG可短期保存于4℃冰箱中備用。 【結(jié)果判斷】 用單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定濃縮液IgG含量，用抗人全血清作免疫電泳測(cè)定純度，如純化成功，應(yīng)只在IgG部位出現(xiàn)沉淀線。 【注意事項(xiàng)】 1.纖維素裝柱時(shí)，不能出現(xiàn)斷層、氣泡，柱面要平整。 2.緩沖液平衡要充分。 3.加血清量不宜過(guò)多。 【應(yīng)用與評(píng)價(jià)】 該方法是目前最廣泛應(yīng)用的高分子物質(zhì)提純方法之一�？侷gG或特異性IgG均可用本法純化。純化的IgG雜蛋白少，可做為免疫原、包被用抗體或用標(biāo)記物標(biāo)記。 【思考題】 離子交換層析純化IgG的原理是什么？ 附 單克隆抗體制備簡(jiǎn)介 目前，商品單克隆抗體已有數(shù)百種, 常規(guī)使用的單抗試劑盒已廣泛地用于病原體(病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)) 、腫瘤標(biāo)志物、激素、自身抗體、細(xì)胞表面抗原等的檢測(cè)。全國(guó)單抗診斷試劑年市場(chǎng)不低于10億元。治療用單抗正在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)中�，F(xiàn)在廠家或試劑公司除提供單抗試劑盒外，提供的單抗和標(biāo)記的單抗，一般是小量分裝的, 標(biāo)明有特異性、類(lèi)型、效價(jià)、用途、規(guī)格和價(jià)格等。 單克隆抗體是用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的。其制備包括兩個(gè)主要步驟： (一)雜交瘤細(xì)胞的制備 用于生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤是能分泌特定抗體的、能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的、單個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞系(克隆)。其簡(jiǎn)要制備過(guò)程如下： 1.親本細(xì)胞 ①免疫脾細(xì)胞：抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞制成懸液；②骨髓瘤細(xì)胞：不產(chǎn)生Ig，次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)陰性。 2.雜交 少量濃集的親本細(xì)胞混合，緩慢加入聚乙二醇(PEG 1000)，稍后加營(yíng)養(yǎng)液稀釋。 3.選擇 用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)液將細(xì)胞分散后進(jìn)行培養(yǎng)。 4.檢測(cè) 用血清學(xué)方法(多用ELISA法)檢測(cè)有細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)上清液, 尋找能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞。 5.克隆 將能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞充分稀釋至每孔一個(gè)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)。 6.再檢測(cè) 再用血清學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液，尋找能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞。 克隆、檢測(cè)可反復(fù)進(jìn)行，直至確認(rèn)所需抗體為單個(gè)細(xì)胞的后代，即單一克隆所產(chǎn)生分泌。 7.保存 用液氮保存能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。 (二)單克隆抗體生產(chǎn) 用雜交瘤細(xì)胞大量生產(chǎn)所需的單克隆抗體。具體方法如下： 1.從液氮中復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞, 制成懸液。 2.將雜交瘤細(xì)胞注入一周前曾注射過(guò)液體石蠟等刺激物于腹腔中的Balb/c小鼠腹腔中。 3.1～2周后收獲腹水，離心取上清液。純化鑒定后分裝、保存。 |
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