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pursuream至尊木蟲 (正式寫手)
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[求助]
鎳柱純化后的蛋白，上下翻轉(zhuǎn)混勻時(shí)易聚沉，是容易氧化嗎？ 已有1人參與
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如題，我做的蛋白280個(gè)氨基酸，其中7個(gè)Cys， 鎳柱純化后純度不錯(cuò)，但是很不穩(wěn)定。為了防止蛋白濃縮前就沉在濃縮管中，我會(huì)在15ml管中預(yù)混合幾管蛋白，如果小心操作，用移液槍吹吸混勻，最高可以濃縮到5mg/ml左右；如果上下翻轉(zhuǎn)混勻，就會(huì)在管中迅速沉淀，伴有大量泡沫（絮狀沉淀會(huì)掛在氣泡上）而吹吸混合幾乎不產(chǎn)生泡沫。 基于這個(gè)現(xiàn)象，我分析是Cys容易氧化的過。但師姐說不大可能，因?yàn)閎uffer中已經(jīng)加了10mM的β-me，Cys也不會(huì)氧化的那么快。 各位覺得是什么原因呢？ 如果這個(gè)蛋白確實(shí)是極不耐氧，在進(jìn)一步的純化中，有什么提高穩(wěn)定性的方案么？除了過完鎳柱后補(bǔ)加還原劑~ 另外，此蛋白是個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子，不穩(wěn)定可能和DNA結(jié)合區(qū)域有關(guān)，有沒有什么穩(wěn)定DNA結(jié)合區(qū)的buffer？（類似于《從純化到星辰》中提到的穩(wěn)定CDC6用的磷酸+谷氨酸buffer） |
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2樓2012-07-09 20:00:41
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4樓2014-03-25 10:24:31
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5樓2014-03-31 16:04:13
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