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鐵桿木蟲 (小有名氣)

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celia2012: 金幣+1 2012-07-19 10:01:34

做菌種保存在-80度冰箱里，分成小包裝，用著也方便。常溫下不能保存

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11樓2012-07-18 10:21:40

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dongxie1982

銅蟲 (正式寫手)

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celia2012: 金幣+4, ★★★★★最佳答案 2012-07-19 10:02:44

甘油冷凍保藏法
本方法適合于中、長期菌種保藏，保藏時間一般為2-4年左右。
（1）用火焰滅菌的接種環(huán)取斜面菌種在平皿上劃線分離單菌落。
（2）平皿倒置于30℃或37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24-48小時，至單菌落的大小為3mm左右。
（3）挑取一個單菌落，接種于一個裝50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振蕩培養(yǎng)10-15小時，至菌密度OD600為1.0-1.5。
（4）用火焰滅菌的接種環(huán)取少量種子液，涂片后，作革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)，及是否有雜菌。
（5）按30%甘油：種子液為1：1（V/V）的量加入無菌甘油，混合后分裝至事先滅菌的菌種保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。
冷凍干燥保藏法
　�。�1）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管，大小要求外徑6-7.5mm，長105mm，球部直徑9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘，備用。
　　（2）準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24—48小時的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7-10天。
　�。�3）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml。
　�。�4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。
　　將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4-5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。
　　（5）真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。
　　抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93.3Pa（0.7mmHg）真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持壓力6-8小時即可。
　�。�6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達(dá)到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。
　　此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。
濾紙保藏法
　　（1）將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘。
　�。�2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。
　�。�3）取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
　�。�4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
　　（5）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。
　�。�6）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰熔封，保存于低溫下。
　�。�7）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。
濾紙保藏法
　�。�1）將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘。
　　（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。
　　（3）取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
　�。�4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
　　（5）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。
　�。�6）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰熔封，保存于低溫下。
　�。�7）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。
沙土保藏法
　�。�1）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。
（2）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
（3）烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。
　�。�4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。
　�。�5）烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。
　�。�6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌，烘干。
　�。�7）抽樣進(jìn)行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗(yàn)，直至證明無菌，方可備用。
　�。�8）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。
　�。�9）于每支沙土管中加入約0.5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。
　�。�10）放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務(wù)使在12小時內(nèi)抽干。
　�。�11）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。
　�。�12）若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
　　（13）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。

斜面低溫保藏法
　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。
　　保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2-4個月，移種一次。酵母菌兩個月，移種一次。細(xì)菌最好每月移種一次。
此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會亦較多。
液氮冷凍保藏法
　�。�1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。
　　（2）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。
　�。�3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
　�。�4）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。
　　（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
　�。�6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。
液體石蠟保藏法
　　（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。
　�。�2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。
　�。�3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。
　�。�4）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。
此法實(shí)用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般無芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個月之久。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點(diǎn)是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。

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12樓2012-07-18 11:21:10

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lanhai6589

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個人覺得，如果以后還要長期用的話，建議還是用20％甘油分別把各菌保種保藏起來�，F(xiàn)在是麻煩了一點(diǎn)，但是以后就方便了，以免到時菌死了或者被污染了等等要用沒得用了。

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13樓2012-07-18 17:05:16

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justdoitlt

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celia2012: 金幣+1 2012-07-19 10:03:24

可以用斜面，甘油管，牛奶凍干管，

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lifeisajourney,cherishit,oritwilldestroyyou

14樓2012-07-18 17:10:00

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上官小小

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斜面4攝氏度保存可3個月后轉(zhuǎn)接一下，也可以用-20度冰箱甘油保存6個月左右

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15樓2012-07-19 09:04:49

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如果要長久保存的話，甘油-80℃才是王道，轉(zhuǎn)接次數(shù)多了菌株會退化的···

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科研路艱辛···

16樓2012-07-19 19:56:17

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我們一般一個月以內(nèi)用斜面，4℃冰箱保存。如果要久的話，建議還是用甘油-20℃或者-80℃保存。還有如果不純的話，先要純化一下，再保存。

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縮短距離，然后超越距離

17樓2012-07-20 11:47:41

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引用回帖:

4樓: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 19:04:50
好幾百個？我暈。本來還準(zhǔn)備建議接種保藏甘油管的，這樣就算了。斜面也超麻煩。
建議你用24孔板吧，每個孔接一個菌，幾個板子就可以搞定。為了保證菌不丟失，每個板子重復(fù)2到3個吧。等菌長出后4度保藏。2月一更新 ...

能具體說說接種保藏甘油管的方法嗎？

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18樓2013-05-20 11:18:04

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引用回帖:

10樓: Originally posted by renyanli at 2012-07-18 10:19:01
用斜面保存比較方便，3個月左右傳代一下，想要保存時間稍長些，可以用液體石蠟保存。平板保存菌種不好。

配成培養(yǎng)基，做成斜面，進(jìn)行保藏就可以，簡單方便。

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19樓2013-09-27 18:25:18

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四度冰箱保存，不然就加甘油保存菌種負(fù)70度

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20樓2013-09-30 09:23:52

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[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自動化所實(shí)習(xí) +6	Losir 2026-03-12	7/350	2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] 東南大學(xué)364求調(diào)劑 +5	JasonYuiui 2026-03-15	5/250	2026-03-16 21:28 by 木瓜膏
[考研] 304求調(diào)劑 +5	素年祭語 2026-03-15	5/250	2026-03-16 17:00 by 我的船我的海
[考研] 085600材料與化工求調(diào)劑 +13	enenenhui 2026-03-13	14/700	2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 070305求調(diào)劑 +3	mlpqaz03 2026-03-14	4/200	2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 本科南京大學(xué)一志愿川大藥學(xué)327 +3	麥田耕者 2026-03-14	3/150	2026-03-14 20:04 by 外星文明
[考研] 289求調(diào)劑 +4	這么名字咋樣 2026-03-14	6/300	2026-03-14 18:58 by userper
[考研] 331求調(diào)劑（0703有機(jī)化學(xué) +5	ZY-05 2026-03-13	6/300	2026-03-14 10:51 by Jy?
[考研] 330求調(diào)劑 +3	?醬給調(diào)劑跪了 2026-03-13	3/150	2026-03-14 10:13 by JourneyLucky
[考研] 308求調(diào)劑 +5	是Lupa啊 2026-03-11	5/250	2026-03-13 22:13 by JourneyLucky
[考研] 一志愿211化學(xué)學(xué)碩310分求調(diào)劑 +8	努力奮斗112 2026-03-12	9/450	2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
[考研] 土木第一志愿276求調(diào)劑，科研和技能十分豐富，求新興方向的導(dǎo)師收留 +3	土木小天才 2026-03-12	3/150	2026-03-13 15:01 by JourneyLucky
[考研] 308求調(diào)劑 +3	是Lupa啊 2026-03-12	3/150	2026-03-13 14:30 by 求調(diào)劑zz
[考研] 283求調(diào)劑，材料、化工皆可 +8	蘇打水7777 2026-03-11	10/500	2026-03-13 09:06 by Linda Hu