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lilyopen銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
求SOD，POD和CAT的測定方法 已有3人參與
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| 菜鳥一枚，求大神指導。看了很多文獻，但是方法不統(tǒng)一，頓時迷茫了！師兄師姐不做這些酶............. |
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【答案】應(yīng)助回帖
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lilyopen: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-08-27 08:28:08
lilyopen: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-08-27 08:28:08
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抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測定方法 一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍四唑光化還原法） 1、試劑的配制 （1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。 分別用蒸餾水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。 參考文獻：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267～268。 （2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。 （4）60μM核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。 （5）2.25mM 氮藍四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預冷的研缽中，加入2ml 50mmol/L預冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。 2、酶活性測定 （1）反應(yīng)混合液配制(以60個樣為準)：分別取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻； （2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30μl酶液于試管中 （3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min； 同時做兩支對照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。 （4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測OD560(出現(xiàn)顏色即可測定)。 （5）酶活性計算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（u）。 SOD總活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD總活性/蛋白質(zhì)含量 SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測定時的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測定時應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。 二、POD、CAT酶活性的測定 粗酶液制備同SOD。 1、 過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法） （1）試劑配制： 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混勻即為1000ml PBS(0.2M，pH6.0)； （2）反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準）： 取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml 30％的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。 （3）樣品測定： 取3ml反應(yīng)液并加入30μl酶液，以PBS為對照調(diào)零，而后測定OD470值（測定40秒）。（邊加樣邊測定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）每30S讀數(shù)一次。 （4）酶活性計算：以每min OD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。 POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體積（ml，30ul）。 2、 過氧化氫酶（CAT）活性測定 （1）試劑配制： 0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。 （2）反應(yīng)液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）搖勻即可。 （3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240（紫外）（測定40s）。 （4）酶活性計算：以每min OD值減少0.01為1個酶活性單位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA240：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml， 1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體積（ml, 0.1ml）。 四、超氧陰離子自由基（O2.-）產(chǎn)生速率的測定（羥胺氧化法） 1、試劑的配制 （1）1mM鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml； （2）17mM對氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加熱溶解后定容至400ml； （3）7mMα-萘胺溶液：稱取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。 2、O2.-含量的測定 （1）樣品液提取方法同SOD測定； （2）取0.5ml提取液（酶液）（可視情況調(diào)整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。 （3）在25℃下保溫1小時； （4）依次先加入1ml 17mM對氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速搖勻； （5）在25℃下保溫20min后在3000×g下離心3min后馬上進行測定（或置于冰箱待測）； （6）以對照管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測定OD530值（測定）； （7）O2.-含量的計算：由測得的OD530，查NO2-標準曲線得到[NO2-]；根據(jù)羥胺與O2.-的反應(yīng)式：NH2OH＋2O2.-＋H+ NO2-＋H2O2 ＋H2O 計算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得O2.-產(chǎn)生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鮮重表示）。 O2.-產(chǎn)生速率=（C×V）/（t×W） （nmol min-1g-1鮮重） C為標準曲線上查得的濃度(umol/L)；V為測定時所取提取液用量(葉綠體稀釋后的體積)；t為反應(yīng)時間(60min)；W為樣品鮮重(葉綠體實際質(zhì)量g) 參考文獻：王愛國，羅廣華．植物生理學通訊，1990，（6）：55～57 五、丙二醛含量的測定 1、試劑配制： 10%TCA：100g 三氯乙酸 → 1L 0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸 → 500ml 10%TCA （避光） 2、測定步驟: 0.2 樣品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 離心 10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水煮30min →冷卻，離心→上清OD450，OD532，OD600 3、計算組織中MDA含量： MDA濃度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA含量(umol/g FW)=C×V/W 式中V為提取液體積(1.6ml)，W為樣品鮮重(0.2g)。 六、植物細胞質(zhì)膜透性的測定（電導儀法） （1）取新鮮葉片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自來水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾遍后用吸水紙吸干水分； （2）樣品剪碎（也可打孔取樣）放入試管（或15ml大離心管）中，加10ml去離子水，在室溫下放置3h使葉片充分吸水后測定溶液電導率(R1)； （3）再放入恒溫水浴鍋中在100℃沸水浴中煮20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測定溶液電導率(R2)； （4）用公式計算質(zhì)膜相對透性（用相對電導率表示）： 相對電導率（%）=R1/R2×100% 還可以計算植株傷害程度： 傷害率=（處理電導率—對照電導率）/（煮沸電導率—對照電導率）×100% 七、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍染色法） 1、試劑的配制 （1）考馬斯亮藍溶液配制：稱取100 mg考馬斯亮藍，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1Ｌ。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個月。 （2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）標準溶液：稱取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再從中吸取40ml用蒸餾水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即為100μg/ml標準BSA溶液）。 標準曲線的制作： 配制0～100µg/ml血清白蛋白血液 管號 1 2 3 4 5 6 100µg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白質(zhì)含量（ml） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液 管號 7 8 9 10 11 12 100µg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白質(zhì)含量（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1ml 酶液（做三個重復） + 2.9ml考馬斯亮藍G-250―――混勻，放置2min后在595nm下比色。 2、樣品可溶性蛋白含量的測定 （1）樣品可溶性蛋白含量測定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸緩沖液（即稀釋成0.1ml提取液），再加入2.9ml考馬斯亮藍溶液，反應(yīng)2min后測OD595（以100μl緩沖液加2.9ml考馬斯亮藍為對照調(diào)零）。 （2）蛋白質(zhì)含量計算： 可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000) C為標準曲線查得的蛋白質(zhì)含量（μg）；VT為提取液總體積（稀釋后的體積ml）；VS為測定時所用提取液體積（ml，20μl）；W為樣品鮮重（g）。 八、彗星實驗 采用機械分離方法分離植物細胞核：植物組織放人預冷的培養(yǎng)皿中，冰上冷凍10min，加人一定體積緩沖液，機械分離葉片細胞核，以緩沖液充分沖洗葉片使細胞核游離，并傾斜培養(yǎng)皿使細胞核聚集，吸取30斗L細胞核的懸浮液加入一定的溴化乙錠染色后于熒光顯微鏡下觀察或進行彗星實驗．機械分離方法分別采用Sorensen buffer、1×PBS、0．4tool•L～Tris—HCl 3種緩沖液進行 機械法分離細胞核取處理過的根尖或幼苗葉片切成適當大小.以煙草葉片為例，切成1cm×2cm 放于事先在冰上預冷的直徑60cm 培養(yǎng)皿中，以250μL（400mM、pH7.0）Tris-HCl 或1×PBS 展開，用新的不銹鋼刀片在葉片或根尖上輕劃，并用緩沖液反復沖洗即可將游離出來的細胞核從葉片或根尖上沖洗到緩沖液中，操作中注意將培養(yǎng)皿傾斜放置以達到富集細胞核的目的，此外，操作要在微暗或黃光下進行，避免分離過程中造成人為的細胞核損傷。 |
12樓2012-08-26 23:04:12
num20062622
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4樓2012-07-26 10:26:45
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