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wjj1139新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
電泳圖怎么全是引物二聚體？求解
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| 求大家給我分析一下，為什么電泳圖上全是引物二聚體，而我們的目的條帶沒(méi)有出來(lái)，退火溫度已經(jīng)很低了。。 |
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2012-07-24 16:50:15, 2.74 M
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4樓2012-08-10 09:39:40
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2樓2012-08-06 17:27:47
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-13 15:08:58
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-13 15:08:58
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復(fù)制的的別人的 1. 從引物自身著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問(wèn)題的辦法； 2. 可能模板有問(wèn)題； 3. 模板濃度過(guò)小，適當(dāng)加大模板量； 4. Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過(guò)高，可降低它們的濃度； 5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會(huì)消失的； 6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強(qiáng)特異性； 7. PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加TAq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。 8. 增加循環(huán)數(shù)； 9. 降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度而定，片段長(zhǎng)則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）； 10. 若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l沒(méi)有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒(méi)有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對(duì)。 11. 以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長(zhǎng)可以稀釋50-100倍 |
6樓2012-08-10 14:31:47
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