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未央mercedes新蟲 (初入文壇)
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[交流]
cDNA鏈的連接、包裝及轉(zhuǎn)染
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實(shí)驗(yàn)概要 本實(shí)驗(yàn)介紹了構(gòu)建cDNA文庫中的cDNA鏈的連接、包裝及轉(zhuǎn)染流程。 主要試劑 EcoRⅠ連接子試劑盒 主要設(shè)備 恒溫水浴，離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、紫外觀測(cè)儀 實(shí)驗(yàn)步驟 1. cDNA加接頭反應(yīng) 1) 按下表準(zhǔn)備反應(yīng)體系 10×緩沖液T4DNA連接酶 3μl BSA 3μl cDNA 2.5μl 連接子 1μl T4DNA連接酶 1μl 加水至 30μl 2) 15℃保溫6-18小時(shí)。 3) 70℃加熱10分鐘后放置于冰浴。 2. 磷酸化反應(yīng) 1) 按下表準(zhǔn)備反應(yīng)體系 上述1.a反應(yīng)物 30μl T4磷酸激酶10×緩沖液 4μl 0.1mM ATP 2μl T4激酶(10μ/μl) 1μl 水 3μl 總體積 40μl 2) 37℃保溫30分鐘。用DNA純化柱純化帶接頭的cDNA。 3) 用1ml Sephacryl S-400裝柱，TEN緩沖液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min。 4) 上樣，用1mlTEN緩沖液洗柱2次，收集洗脫液。洗脫時(shí)加套管，800g5min。 5) 合并洗脫液。 6) 3M NaAC和無水乙醇沉淀，干燥復(fù)溶。 3. cDNA與載體聯(lián)接： 1) 準(zhǔn)備4個(gè)離心管，按下表加入 A B C D 載體DNA0.5ug/ul) 2 cDNA(10ng/ul) 0 3 2 1 10×T4DNA連接酶緩沖液 1 水 6 3 4 5 T4DNA連接酶 1 2) 保溫，室溫:3小時(shí);4℃過夜。 4. 體外包裝： 1) 從－70℃取出包裝蛋白，冰浴中溶化，每管50ul。 2) 包裝蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的連接液，輕彈管壁，輕輕混勻。 3) 22℃（室溫）放置3小時(shí)。 4) 上述包裝混合液中加入445ul的phage緩沖液和25ul氯仿，輕輕混勻，冰浴保存。（包裝液4℃下可存放7天）。 5. 感染 1) 滅菌培養(yǎng)皿中倒入下層LB培養(yǎng)基，凝固后，37℃保溫。 2) 安1：1000的比例稀釋“4”中的包裝混合液。 3) 取100ul稀釋液和100ul菌株（Y1090、LE392）。 4) 取4ml熔化45℃保溫的上層培養(yǎng)基加入到“c”中的混合液中，混勻后鋪板在37℃預(yù)熱的下層培養(yǎng)基上，37℃過夜。 6. 收集和擴(kuò)增文庫 構(gòu)建的cDNA文庫經(jīng)擴(kuò)增后，才能保存和進(jìn)行長(zhǎng)期篩選。本文庫由λgt11作為載體而構(gòu)成，因此擴(kuò)增時(shí)應(yīng)在大腸桿菌Y1090中進(jìn)行。 1) 過夜后的皿上挑取出現(xiàn)的噬菌斑，加2－3mlSM緩沖液，室溫震蕩２小時(shí)。４℃7000g離心30min，以除去細(xì)胞碎片，分裝上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速離心10min，以除去細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基成分。 2) 重復(fù)上步操作。 3) 上清液轉(zhuǎn)入一新管 中，如要在4℃短期保存則按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要長(zhǎng)期保存則應(yīng)加入終濃度為７％的二甲基亞砜，于－70℃保存。以被需要時(shí)重新涂板篩選文庫。 來自E V E R L A B 云端實(shí)驗(yàn)室 |
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