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無(wú)風(fēng)仍脈脈新蟲 (初入文壇)
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2樓2012-08-18 07:38:09
【答案】應(yīng)助回帖
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抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測(cè)定方法 一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定（氮藍(lán)四唑光化還原法） 1、試劑的配制 （1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。 分別用蒸餾水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。 參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267～268。 （2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。 （4）60μM核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。 （5）2.25mM 氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入2ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。 2、酶活性測(cè)定 （1）反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn))：分別取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻； （2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30μl酶液于試管中 （3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min； 同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后測(cè)定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測(cè)定時(shí)用于調(diào)零。 （4）以不照光的對(duì)照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測(cè)OD560(出現(xiàn)顏色即可測(cè)定)。 （5）酶活性計(jì)算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量（測(cè)的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個(gè)酶活單位（u）。 SOD總活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD總活性/蛋白質(zhì)含量 SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測(cè)定時(shí)的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測(cè)定時(shí)應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。 二、POD、CAT酶活性的測(cè)定 粗酶液制備同SOD。 1、 過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定（愈創(chuàng)木酚法） （1）試劑配制： 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混勻即為1000ml PBS(0.2M，pH6.0)； （2）反應(yīng)混合液配制（以60個(gè)樣為準(zhǔn)）： 取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml 30％的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。 （3）樣品測(cè)定： 取3ml反應(yīng)液并加入30μl酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，而后測(cè)定OD470值（測(cè)定40秒）。（邊加樣邊測(cè)定，測(cè)定前等待5秒，動(dòng)作要快，如果慢的話，要保證每個(gè)樣品從加好樣到開始記時(shí)的時(shí)間相差不大）每30S讀數(shù)一次。 （4）酶活性計(jì)算：以每min OD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。 POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml，30ul）。 2、 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定 （1）試劑配制： 0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。 （2）反應(yīng)液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）搖勻即可。 （3）樣品測(cè)定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定OD240（紫外）（測(cè)定40s）。 （4）酶活性計(jì)算：以每min OD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA240：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml， 1.6ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml, 0.1ml）。 四、超氧陰離子自由基（O2.-）產(chǎn)生速率的測(cè)定（羥胺氧化法） 1、試劑的配制 （1）1mM鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml； （2）17mM對(duì)氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對(duì)氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加熱溶解后定容至400ml； （3）7mMα-萘胺溶液：稱取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。 2、O2.-含量的測(cè)定 （1）樣品液提取方法同SOD測(cè)定； （2）取0.5ml提取液（酶液）（可視情況調(diào)整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。 （3）在25℃下保溫1小時(shí)； （4）依次先加入1ml 17mM對(duì)氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速搖勻； （5）在25℃下保溫20min后在3000×g下離心3min后馬上進(jìn)行測(cè)定（或置于冰箱待測(cè)）； （6）以對(duì)照管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測(cè)定OD530值（測(cè)定）； （7）O2.-含量的計(jì)算：由測(cè)得的OD530，查NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到[NO2-]；根據(jù)羥胺與O2.-的反應(yīng)式：NH2OH＋2O2.-＋H+ NO2-＋H2O2 ＋H2O 計(jì)算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得O2.-產(chǎn)生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鮮重表示）。 O2.-產(chǎn)生速率=（C×V）/（t×W） （nmol min-1g-1鮮重） C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度(umol/L)；V為測(cè)定時(shí)所取提取液用量(葉綠體稀釋后的體積)；t為反應(yīng)時(shí)間(60min)；W為樣品鮮重(葉綠體實(shí)際質(zhì)量g) 參考文獻(xiàn)：王愛國(guó)，羅廣華．植物生理學(xué)通訊，1990，（6）：55～57 五、丙二醛含量的測(cè)定 1、試劑配制： 10%TCA：100g 三氯乙酸 → 1L 0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸 → 500ml 10%TCA （避光） 2、測(cè)定步驟: 0.2 樣品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 離心 10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水煮30min →冷卻，離心→上清OD450，OD532，OD600 3、計(jì)算組織中MDA含量： MDA濃度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA含量(umol/g FW)=C×V/W 式中V為提取液體積(1.6ml)，W為樣品鮮重(0.2g)。 六、植物細(xì)胞質(zhì)膜透性的測(cè)定（電導(dǎo)儀法） （1）取新鮮葉片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自來(lái)水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾遍后用吸水紙吸干水分； （2）樣品剪碎（也可打孔取樣）放入試管（或15ml大離心管）中，加10ml去離子水，在室溫下放置3h使葉片充分吸水后測(cè)定溶液電導(dǎo)率(R1)； （3）再放入恒溫水浴鍋中在100℃沸水浴中煮20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測(cè)定溶液電導(dǎo)率(R2)； （4）用公式計(jì)算質(zhì)膜相對(duì)透性（用相對(duì)電導(dǎo)率表示）： 相對(duì)電導(dǎo)率（%）=R1/R2×100% 還可以計(jì)算植株傷害程度： 傷害率=（處理電導(dǎo)率—對(duì)照電導(dǎo)率）/（煮沸電導(dǎo)率—對(duì)照電導(dǎo)率）×100% 七、可溶性蛋白含量的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)染色法） 1、試劑的配制 （1）考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1Ｌ。在過(guò)夜后過(guò)濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個(gè)月。 （2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再?gòu)闹形?0ml用蒸餾水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即為100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液）。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 配制0～100µg/ml血清白蛋白血液 管號(hào) 1 2 3 4 5 6 100µg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白質(zhì)含量（ml） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液 管號(hào) 7 8 9 10 11 12 100µg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白質(zhì)含量（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1ml 酶液（做三個(gè)重復(fù)） + 2.9ml考馬斯亮藍(lán)G-250―――混勻，放置2min后在595nm下比色。 2、樣品可溶性蛋白含量的測(cè)定 （1）樣品可溶性蛋白含量測(cè)定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸緩沖液（即稀釋成0.1ml提取液），再加入2.9ml考馬斯亮藍(lán)溶液，反應(yīng)2min后測(cè)OD595（以100μl緩沖液加2.9ml考馬斯亮藍(lán)為對(duì)照調(diào)零）。 （2）蛋白質(zhì)含量計(jì)算： 可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000) C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)含量（μg）；VT為提取液總體積（稀釋后的體積ml）；VS為測(cè)定時(shí)所用提取液體積（ml，20μl）；W為樣品鮮重（g）。 八、彗星實(shí)驗(yàn) 采用機(jī)械分離方法分離植物細(xì)胞核：植物組織放人預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，冰上冷凍10min，加人一定體積緩沖液，機(jī)械分離葉片細(xì)胞核，以緩沖液充分沖洗葉片使細(xì)胞核游離，并傾斜培養(yǎng)皿使細(xì)胞核聚集，吸取30斗L細(xì)胞核的懸浮液加入一定的溴化乙錠染色后于熒光顯微鏡下觀察或進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)．機(jī)械分離方法分別采用Sorensen buffer、1×PBS、0．4tool•L～Tris—HCl 3種緩沖液進(jìn)行 機(jī)械法分離細(xì)胞核取處理過(guò)的根尖或幼苗葉片切成適當(dāng)大小.以煙草葉片為例，切成1cm×2cm 放于事先在冰上預(yù)冷的直徑60cm 培養(yǎng)皿中，以250μL（400mM、pH7.0）Tris-HCl 或1×PBS 展開，用新的不銹鋼刀片在葉片或根尖上輕劃，并用緩沖液反復(fù)沖洗即可將游離出來(lái)的細(xì)胞核從葉片或根尖上沖洗到緩沖液中，操作中注意將培養(yǎng)皿傾斜放置以達(dá)到富集細(xì)胞核的目的，此外，操作要在微暗或黃光下進(jìn)行，避免分離過(guò)程中造成人為的細(xì)胞核損傷。 |
3樓2012-08-26 22:54:46
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