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[求助]
植物原生質(zhì)體
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我最近在提取原生質(zhì)體，我做的是小麥的，我試了2個(gè)方案 方案一： 試劑： (1)酶液 1％纖維素酶 1％果膠酶 0.7mol/L（12.7519g溶于100mL）甘露醇 0.7mmol/L(0.00952g溶于100mL)KH2PO4 10mmol/L(0.14698g溶于100mL)CaCl2•2H2O pH6.8—7.0 (2)13％CPW洗液 27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2•2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 13％ W／V甘露醇 pH 6.0 (3)20％蔗糖溶液 步驟： 取無菌葉，切成薄片后，置于酶液中和搖床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗條件下，酶解5～7h。 用200目網(wǎng)過濾除去未完全消化的殘?jiān)Ｔ?000rpm條件下離心5分鐘，棄上清。 加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同條件下離心2-5分鐘，棄上清，留1ml洗液。 用滴管將混有原生質(zhì)體的1ml洗液吸也，輕輕鋪于20％蔗糖溶液上(5ml離心管裝3m120％蔗糖溶液)，在1000rpm條件下離心5—10分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強(qiáng)狀態(tài)好的原生質(zhì)體漂浮在20％的蔗糖與13％ CPW之間，破碎的細(xì)胞殘?jiān)寥牍艿住?br /> 用200μl移液器輕輕將狀態(tài)好的原生質(zhì)體吸出(注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液)，放入另一干凈的離心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm離心2-5分鐘，棄上清． 用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整原生質(zhì)體密度為105一106/ml之間。 方案二： 試劑： (1)酶:洗液+1.5%纖維素酶Onozyka RS+0.3%果膠酶Y-23，調(diào)PH為5.7-5.8然后以0.22μm微孔濾膜抽濾滅菌; 洗液:10.92g甘露醇+55.sgCaC12+looml水，pH5.7-5.8，高壓蒸汽滅菌 步驟： ①取葉片剁碎以后，分別經(jīng)含有纖維素酶(1%w/v)和果膠酶 (0.3%w/v)的混合酶液處理3-4h，新游離出的原生質(zhì)體圓、透明、內(nèi)含物較多; ②用置于9cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)300μm不銹鋼網(wǎng)過濾酶解產(chǎn)物，過濾下的原生質(zhì)體和酶混合液轉(zhuǎn)入5ml離心管中，用洗液沖洗濾網(wǎng)兩次，將液體轉(zhuǎn)入另一離心管中 ③500rpm離心5min，收集原生質(zhì)體，小心吸出上清(酶液)，回收備用，不要觸動(dòng)原生質(zhì)體 ④加入PBS緩沖液至離心管中，用吸管將沉淀全部吹起，形成均勻懸液，500rpm離心5min，小心吸出上清(PBS緩沖液)，收集原生質(zhì)體 ⑤重復(fù)步驟④2-3次，以去掉殘留的酶液 ⑥離心管中加入PBS緩沖液，制成濃度105個(gè)/ml的均勻懸液 問題：1.酶液怎么配比較好呢？看這兩個(gè)方案中配的不大一致，哪個(gè)好？酶的用量多少合適？酶解的時(shí)間多久合適？還有洗液要求高嗎?兩個(gè)方案也差好多，而且第一個(gè)方案的洗液配起來超麻煩。 2.下面這個(gè)問題比較困惑，就是方案一需要20%蔗糖，方案二不需要,蔗糖說是用來提取活力高的原生質(zhì)體，但是我用方案一的時(shí)候，分層不大明顯，我把上面的說是帶有高活性原生質(zhì)體的液體洗出來時(shí)感覺跟吸水差不多，然后就把最底層的離心出來的沉淀扔了（按方案一的說法這些沉淀都是死細(xì)胞或者破碎細(xì)胞），第二個(gè)方案我卻直接用的離心完的沉淀，也就是說我取的都是死細(xì)胞？但是人家用方案二的人卻做出來了呀。 3.離心時(shí)這個(gè)轉(zhuǎn)速的問題。。。500、1000rpm,感覺有點(diǎn)小啊，有時(shí)離心完感覺沉淀還不明顯呢，稍微一動(dòng)就渾濁了。。。 以上就是我的眾多疑問。。。有點(diǎn)多。。。沒辦法。。。斷斷續(xù)續(xù)的做了好幾個(gè)月了眼看馬上就要開始做試驗(yàn)了還做不出來，我沒人可問，實(shí)驗(yàn)室?guī)煾鐜熃愣际亲鲷~做蚯蚓的。。。。我第一個(gè)做植物的問他們也不明白。。。還是來這里問問，希望有經(jīng)驗(yàn)的懂點(diǎn)的都來說兩句，會(huì)哪個(gè)問題就說哪個(gè)就行，謝謝�。�！ |
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a71840584: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-09-06 20:05:01
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a71840584: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-09-06 20:05:01
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1、有一種煤叫做崩潰酶，蝸牛酶，做原生質(zhì)體不錯(cuò)。 2、原生質(zhì)體提起出來之后，還需要再生細(xì)胞壁，需要專門的培養(yǎng)基。 3、高滲溶液一般用ＰＥＧ配置，用蔗糖的不多。 4、葉片不能太老，酶解時(shí)間很重要。 5、過濾可以用顯微鏡的擦鏡紙、漏斗分離（上述東西都要滅菌） |
2樓2012-08-26 22:25:06
starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
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1 文獻(xiàn)不可不信不可盡信，尤其是中文文獻(xiàn)。具體應(yīng)該用什么樣的酶液，這需要你自己摸索。植物材料狀態(tài)，你的操作，試劑等等影響很大，樓主不妨把兩種酶液都試試，尋找效果最好的組合。 2 第一種方法重點(diǎn)在于梯度離心分離狀態(tài)最好的原生質(zhì)體，第二種則希望盡可能收集所有細(xì)胞，各有利弊。如果你酶解后細(xì)胞情況較好，可以考慮第一種方法，如果大量細(xì)胞在酶解后破碎死亡，用第二種。 3 原生質(zhì)體非常脆弱，一點(diǎn)點(diǎn)機(jī)械損傷就可能殺死它們，500-1000 rpm很正常，要避免再懸浮，操作小心一點(diǎn)。 樓上蟲友的回答有一點(diǎn)答非所問，但談到的確實(shí)是幾個(gè)做原生質(zhì)體的要點(diǎn)，非常值得參考 |
3樓2012-08-27 01:58:00
robocop
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4樓2012-12-23 23:06:34
starseacow
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5樓2012-12-24 01:33:33
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