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跪求各位高人：這個(gè)Western 到底出什么問題了啊
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各位蟲高人： 小蟲我最近在做WESTERN ,做的是tPA,做了有一個(gè)月了，但是結(jié)果是各種奇怪，我也是通過各種方法去驗(yàn)證，去改正，但是又出了這樣的結(jié)果，我直接崩潰。首先我的大概流程是這樣的。 1，TPA的分子量為63KD，我選用10%的分離膠，5%的濃縮膠，濃縮膠恒壓70V, 分離膠是100V. 2，濕轉(zhuǎn)，恒壓，110V,1H 40mins。轉(zhuǎn)膜后的膠和NC膜我分別用考馬斯亮藍(lán)和麗春紅去染色，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效率很高。 3，用5%的脫脂牛奶封閉1H. 4，一抗稀釋比例從1:1000到1:50，前面一直不出來，沒有任何條帶，直到1:100和1:50，但結(jié)果很奇怪，所有蛋白全會曝出來，（結(jié)果會在后面附圖，稀釋液用了封閉液，也用了TBST嘗試）。一抗是4度過夜孵育。 5，二抗稀釋比例是1:3000，孵育一小時(shí)，同樣是用過封閉液或TBST 稀釋。 6，用ECL發(fā)光液，稀釋10倍。 7，曝光從最初的3s到后面的2h。 現(xiàn)在不知道是哪里出問題了，可是前面是一直做不出來，曝光的片子上沒有任何條帶，但是昨天做的一抗稀釋比例 1:100和1:50的結(jié)果更是詫異，現(xiàn)在我是沒法了，請求高人指點(diǎn)一二，小蟲我先謝過了。 附注圖片：這是一抗1:100的結(jié)果 我的目的蛋白條帶應(yīng)該在上面，最亮的條帶不是我的目的蛋白，這是怎么回事��？怎么可以檢測到其它蛋白呢，還比目的蛋白的條帶亮？ 1.jpg |
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