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[交流]
求PCR實驗的推薦
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本人最近在學PCR，求推薦此方向的好的資源（主要是書籍） 需要的是專門講解PCR的，內容廣泛，而不是在某本書中只是提到 注：我只想知道資源的名字并不是向他人索要資源，所以請版主鑒別后不要刪 [ Last edited by laqiwe on 2012-9-20 at 12:41 ] |
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laqiwe(金幣+1): 謝謝參與
laqiwe: 回帖置頂 2012-10-05 18:04:06
laqiwe: 金幣+4 2012-10-05 18:04:14
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實驗七 聚合酶鏈反應（PCR）技術體外擴增DNA 目的 1、學習PCR反應的基本原理和實驗技術。 2、了解引物設計的一般要求。 原理 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是體外酶促合成DNA片段的一種技術。利用PCR技術可在數小時之內大量擴增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。 PCR進行的基本條件： ⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）； ⑵引物； ⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ⑷Taq DNA聚合酶 PCR循環(huán)由三個步驟組成： ⑴變性 使模板DNA解離成單鏈； ⑵退火 使引物與模板DNA所需擴增序列結合； ⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成與模板堿基序列互補的DNA鏈。 每一個循環(huán)的產物可作為下一個循環(huán)的模板，通過30個左右循環(huán)后，目的片段的擴增可達106倍。 引物設計：要保證PCR反應能準確，特異，有效的對引物DNA進行擴增，通常引物設計要遵循以下原則： ⑴引物長度：15~25個核苷酸； ⑵CG含量為40%~60%； ⑶Tm值為55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）計算； ⑷引物與非特異配對位點的配對率小于70%； ⑸引物自身配對形成的莖環(huán)結構，莖的堿基對小于3， ⑹兩條引物間配對堿基數小于5個。 由于影響引物的設計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設計。 本實驗以實驗一中提取的質粒DNA為模板，進行PCR擴增，大量得到目的DNA片段。 試劑與器材 一、 試劑 1、 Taq DNA聚合酶 2、 10×反應緩沖液（含25mmol MgCl2） 3、 dNTP 4、 引物（P1、P2） 5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。 6、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。 二、 器材 1、 PCR擴增儀 2、 電泳儀 3、 臺式離心機 4、 紫外分析儀 5、 恒溫水浴 6、 凝膠成像系統(tǒng) 操作步驟 一、 PCR擴增 1、按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實驗一中提取的質粒DNA。 試劑 體積（ 50ul） ddH2O 35ul 10 x buffer 5ul 10×dNTP 5ul Primer P1 1ul Primer P2 1ul 模板 2ul Taq 酶（2.5U） 1.0ul 2、設置PCR程序： 94 ℃ 180s 94 ℃ 45s 35 cycles: 55℃ 45s 72 ℃ 60s 72 ℃ 600s 3、運行PCR程序 二、 PCR產物鑒定 反應結束后，取20ul PCR產物進行1.2%瓊脂糖電泳分析。 這個也是下載的 供參考 |
6樓2012-10-04 22:40:25
2樓2012-09-20 09:54:16
3樓2012-09-20 10:19:44
4樓2012-09-20 11:15:39
5樓2012-09-20 20:42:54
簡單回復
2012-10-05 07:39
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laqiwe(金幣+1): 謝謝參與
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