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急求！GFP載體轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌以及紅霉素濃度 已有1人參與
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因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室要轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌做GFP，首先從菌種庫(kù)里買了1.從土壤里分離的枯草芽孢桿菌2.從公司里買的帶有GFP的可以轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的載體pMUTIN-GFP+（在大腸桿菌里是氨芐抗性，在芽孢桿菌中是紅霉素抗性） 因?yàn)椴皇亲鲚d體構(gòu)建，只要把GFP空載轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌就行了，剛開始先轉(zhuǎn)化進(jìn)了大腸桿菌，這一步很順利，然后把提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌時(shí)出了問題。 首先是紅霉素配置的問題。在網(wǎng)上查到紅霉素是用無水乙醇溶解，儲(chǔ)存濃度一般在50mg/ml或者100mg/ml，但是我用無水乙醇溶這個(gè)濃度根本溶解不了，無論是用攪拌子攪拌或者怎么混勻，就是溶解不了，最后只能減少濃度，試了半天最后配成1mg/ml的濃度才能勉強(qiáng)溶解，  但是這個(gè)濃度太低了，而我需要轉(zhuǎn)化的是野生型的枯草芽孢桿菌，抗性比較強(qiáng)，我做過梯度，一般LB培養(yǎng)基需要的紅霉素濃度至少是50ug/ml，這樣的話我配100ML培養(yǎng)基就要加5ML抗生素，我怕這個(gè)會(huì)對(duì)培養(yǎng)基有影響。不知道一般枯草芽孢桿菌對(duì)所用紅霉素的濃度是多少，而且應(yīng)該怎么配置，請(qǐng)大家?guī)蛶兔獯鹨幌拢?br />
其次是轉(zhuǎn)化問題。因?yàn)槲仪懊孀鲞^梯度，用LB培養(yǎng)基紅霉素濃度是50ug/ml時(shí)，我的原菌是不長(zhǎng)的，所以在轉(zhuǎn)化之后我也用了這個(gè)濃度，可是在轉(zhuǎn)化后12h左右，平板(紅霉素終濃度50ug/ml)上長(zhǎng)滿菌（現(xiàn)象如抗生素失效一樣），全是一大片一大片的，關(guān)鍵是我用的感受態(tài)陰性對(duì)照沒有加任何質(zhì)粒的也長(zhǎng)了滿板，我又把抗生素濃度加大到100ug/ml，還是同樣的情況，連陰性對(duì)照都是長(zhǎng)了大片的菌，完全沒有單菌落，全是一片一片的，可是我用同一次配的加了紅霉素的培養(yǎng)基去劃線，板上是完全不會(huì)漲的，我用的轉(zhuǎn)化方法是普通的化學(xué)轉(zhuǎn)化法，方法如下：一、取對(duì)數(shù)末期的菌作為制備感受態(tài)細(xì)胞 二、轉(zhuǎn)化方法：于第一天上午取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB平板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。挑單菌落至3ml LB培養(yǎng)基中，37℃， 250 rmin培養(yǎng)過夜。第二天上午取160 μl培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI培養(yǎng)基中，37℃，250 rmin培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期 (約4~5 h)，取0.2 ml培養(yǎng)液至2 ml SPII培養(yǎng)基中，37℃，100 rmin培養(yǎng)90 min ，加入20ul 10mmolL EGTA，再于37℃，100 rmin培養(yǎng)10分鐘。分裝成0.5 ml每管，各加入5ul DNA，再于37℃，250rmin培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布篩選平板。 試劑： SP鹽：0.2%（NH4）2SO4, 1.4%K2HPO4, 0.6%KH2PO4, 0.02%MgSO4•7H2O, 0.1%檸檬酸鈉； SPⅠ培養(yǎng)基：SP鹽溶液加入1%體積濃度為50%葡萄糖溶液，1%體積100×CAYE溶液； SPⅡ培養(yǎng)基：SPⅠ培養(yǎng)基加入1%體積50mmol/LCaCl2溶液，1%體積250mmol/L MgCl2溶液。 SP－A Salts Solution：（500 ml Solution） 0.4％ (NH4)2SO4 2g 2.8% K2HPO4•3H2O 14g 1.2% KH2PO4 6g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g 121℃滅菌20min SP－B Salts Solution：（500 ml Solution） 0.04% MgSO4•7H2O 0.2g 121℃滅菌20min 100× CAYE Solution：（100 ml Solution） 2％ Casamino acid 2g 10％ Yeast Extract 10g 121℃滅菌20min SPI Medium：（20 mL） 9.8mL SP－A Salts Solution 9.8mL SP－B Salts Solution 200µL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃滅菌20min） 200µL （1％V）100× CAYE SPII Medium：（6 mL） 5.88mL SPI Medium 60µL （1％V）50mM CaCl2 60µL （1％V）250mM MgCl2 100×EGTA Solution： 10mmol／L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH至pH8.0 還有一種是 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法 1、菌種在斜面培養(yǎng)2天，孢子形成率接近100%。 2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢搖床（100rpm）振蕩培養(yǎng)過夜。 3、次日取2ml轉(zhuǎn)接到18ml GMⅠ中，37℃快搖床（200rpm）培養(yǎng)3.5小時(shí)。 4、再取10ml轉(zhuǎn)接到90ml GMⅡ中，37℃慢搖床培養(yǎng)90分鐘，離心收集菌體。 5、用10ml上清液懸浮菌體，并加30%的滅菌甘油至10%，混勻后分裝到離心管中（0.5ml/Tube），隨即放到-70℃保存。 6、轉(zhuǎn)化時(shí)取出離心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入適量DNA（1ug/ml）。 7、于37℃緩慢振蕩（80rpm）保溫30分鐘后涂抗性平板，再在37℃培養(yǎng)過夜，次日檢查轉(zhuǎn)化子。 【培養(yǎng)基配方】 1.10×最低鹽溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸餾水中依次溶解，加水至100ml。 2.L- trp溶液，2mg/ml，貯于棕色瓶?jī)?nèi)，113℃滅菌30min，用黑紙包裹。 3.GMⅠ溶液：1×最低鹽溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。 4.GMⅡ溶液：1×最低鹽溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。 于37℃緩慢振蕩（80rpm）保溫30分鐘后涂抗性平板，再在37℃培養(yǎng)過夜，次日檢查轉(zhuǎn)化子。 這兩種方法都用過，結(jié)果是一樣的，全是類似于抗生素失效的結(jié)果。還沒有試過電轉(zhuǎn)。請(qǐng)大家?guī)椭獯鹨幌拢?br /> 急求，我已經(jīng)做了很長(zhǎng)時(shí)間了，實(shí)驗(yàn)停在這一步做不下去了，因?yàn)槲沂换丶遥瑳]法上網(wǎng)，中間大概有5天上不了網(wǎng)，所以不好懸賞金幣，對(duì)不住各位，下次我一定多懸賞一些，多謝多謝 |
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5樓2012-10-17 11:06:53
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6樓2012-10-23 15:19:46
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10樓2012-11-14 16:23:02
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