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wa99999999新蟲 (初入文壇)
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[求助]
大蝦幫忙
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我構(gòu)建載體：目的片斷1800bp左右連接PMD-19載體回收提質(zhì)粒， 載體psilent-1 6700bp,用ApaI 和XhoI 分別分步酶切，回收效果還可以，然后連接 T4連接酶 16度 過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后菌落PCR鑒定陽性克隆，菌落PCR跑出來的大小和目的片斷一樣1800 左右，然后就提取質(zhì)粒，可是 這個(gè)質(zhì)粒提出來跑電泳卻只有2500左右，怎么會(huì)那么�。�，于是 今天我用ApaI切，出來了一條明亮的條帶，也只有5000Bp,不知怎么 回事？ 我那個(gè) 應(yīng)該是1800+6000多 = 起碼都有8000撒，囊個(gè)會(huì)這樣子也 ，哪位高手 幫幫我 看問題出在哪里! 明天準(zhǔn)備再切一次，兩個(gè)酶 分步酶切 看能切成我要的大小不 |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-10-12 15:39:36
wa99999999: 金幣+4, 謝謝 重新連了一次，大小正確了 2012-10-16 09:20:28
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超螺旋質(zhì)粒5k跑到2500一點(diǎn)也不奇怪，所以最好做個(gè)單酶切確定分子量。從你最后的酶切結(jié)果看，載體只有5000bp，肯定是不對的了。 你酶切后是膠回收的還是直接回收的？做連前最后一步的酶切最好切膠回收，確�；厥照_片段，而且可以除去酶切不完全的質(zhì)粒，酶切后載體最好用堿性磷酸酶去5’P，減少載體自連。 |
2樓2012-10-12 07:25:36
loveqiuqiu
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3樓2015-03-26 21:02:50
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