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weining1203新蟲 (小有名氣)
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做原核表達(dá)又出現(xiàn)問題了
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做原核表達(dá)，使用pET-32a表達(dá)載體，酶切位點(diǎn)為sacI和Xhol， 上游引物 5G GAGCTC（SacI）ATGGTTGCAGCAGCAGAAAT3 下游引物 5CCG CTCGAG（Xhol）TCAGAATGGGCCAGGAGTTC3 問題就在這，實(shí)驗(yàn)室的pET-32a酶切位點(diǎn)發(fā)生突變了，于是問同學(xué)要，結(jié)果它只有pET-28a，同學(xué)不做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，不知道能不能通用，有點(diǎn)著急，請(qǐng)做過的同學(xué)指點(diǎn)一下迷津，先謝謝了 |
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cicelyzh
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| pET-28a也有你設(shè)計(jì)的那兩個(gè)酶切位點(diǎn)，所以可以用。不過28a沒有Trx-tag。 |
weining12032樓2012-10-13 08:07:09
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| pET-28a與pET32a不一樣的是它沒有Trx-tag和S-tag，只有His-tag。Trx-tag是硫氧還蛋白，可以助溶，如果你本身的蛋白表達(dá)出來可溶性就很高，沒有Trx-tag也沒關(guān)系，但是如果你的蛋白本身可溶性低的話，用pET28a表達(dá)出來的就可能是包涵體。S-tag和His-tag都是可以用來做westen blot的標(biāo)簽，其中His-tag可以用來純化蛋白。 |
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4樓2012-10-13 09:53:44
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【答案】應(yīng)助回帖
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Trx-tag和GST-tag都可以增加融合蛋白的可溶性。如果你要表達(dá)的蛋白水溶性差容易形成包涵體，多個(gè)tag會(huì)有幫助。對(duì)大多數(shù)可溶蛋白來說，沒有trx-tag影響不大，pET-28a也是大家常用的一個(gè)表達(dá)載體。 |
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5樓2012-10-13 09:55:34
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