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handsome1984鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
Fosmid文庫大片段的陽性克隆子篩選和測序問題
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| 大家好，有人構(gòu)建過Fosmid大片段約40Kb左右的基因組文庫嗎？篩選陽性克隆可以用特異性引物PCR篩選嗎？另外測序是怎么測呢？是提取質(zhì)粒DNA直接測？片段太大了，好像測不了啊。 |
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6樓2012-11-16 10:43:19
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【答案】應(yīng)助回帖
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非常感謝回復(fù)。我還有一下疑問請(qǐng)教： 我的DNA是提取后用低熔點(diǎn)瓊脂糖純化過一次，用DNA濃度測定儀檢測濃度為5000ng/ul，A260/A280=2.072, A260/A230=2.423，這個(gè)參數(shù)應(yīng)該是可以的吧。DNA的大小>40kb，我沒有大的Marker，用試劑盒帶的conrtrol DNA和λ/Hind III 做的marker，有圖片。條帶從左到右分別是：λ/Hind III （15ul），conrtrol DNA（2.5ul），未剪切樣品，剪切500次樣品。后面兩個(gè)是師妹的，片段比我的小。膠破損了，所以有那個(gè)長長的亮帶。 問題來了，普通的λ/Hind III 可以用來做脈沖嗎？總感覺23K的那條帶和conrtrol DNA離得太近了。我的片段這么大的，不做剪切直接補(bǔ)平可以嗎？上次做的時(shí)候還做了切膠回收，從23K帶的上邊緣切到conrtrol DNA帶的上邊緣。我看您說片段越大越好，那您的意思是不用切膠回收也可以的嗎？ 平板涂布后第三天菌落才長出來。據(jù)說氯霉素要皮實(shí)些不會(huì)很快失效，請(qǐng)問一般在37度能維持幾天呢？我用原液做的宿主侵染，比率也擴(kuò)大一倍，用了20ul，最后得到了大約900多個(gè)克隆。 侵染后濃度滴定實(shí)驗(yàn)時(shí)，用不同的稀釋濃度涂布，生長狀況差不多，10的負(fù)1次方和10的負(fù)5次方生長的菌落數(shù)相差不大，30-50個(gè)左右。 以上就是目前碰到的一些問題，說的多，不知道您能不能看明白，還請(qǐng)您不吝賜教。多謝。 11.9脈沖.jpg |
8樓2012-11-21 10:37:06
9樓2012-11-21 12:24:15
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10樓2012-11-21 15:09:08
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