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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » sds崩潰了，求解答
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huangyan0517金蟲 (小有名氣)
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[求助]
sds崩潰了，求解答
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我把步驟說的詳細些： 溶液都是按分子克隆實驗書上配的，30%丙烯酰胺混合液（29:1），1.5mol/，ph8.8的ltris，1mol/l ph6.8tris ，用1mol/l ph6.8tris配的上樣buffer，5倍電泳緩沖液（15.1g tris，94g gly，5g sds，1000ml）。 配膠的過程： 用的伯樂mini 1mm電泳版，板洗干凈之后夾好，晾干，用的時候直接用 分離膠15%，灌完分離膠，用蒸餾水封閉一下，大概1cm的高度 等大概20-30分鐘，倒掉水，濾紙吸干，灌濃縮膠，插梳子，再過半小時拔梳子。 樣品濃度比較高，大概17mg/ml，0.01M的PB溶液，之前是用20ul一倍上樣buffer混合5ul樣品，煮沸1min后上樣，上樣每孔20ul。 電泳條件為濃縮膠20min，分離膠50分鐘。樣品為溶菌酶及其多聚體混合物。 圖如下，左邊兩條為自己做的marker，第一個為bsa，第二個為bsa和溶菌酶單體混合物。 目前問題如下： （1）拔完梳子之后，膠孔會有一層薄膜，應該是梳子和板之間不緊密，有空隙產(chǎn)生的，但是梳子是配套的，每次都會有樣品加不進去的情況，用針挑也跳不干凈，各位有沒有這種情況，怎么解決的？ （2）ph8.8和6.8的ph用濃鹽酸調(diào)好之后，ph還會變化，會增加0.1-0.2的ph，即使調(diào)好之后，還是沒有壓縮效應。 （3）膠配好之后，把板夾到電泳槽上，灌滿電泳緩沖液，幾乎每次第一次都會漏液，第二次就不會，操作完全一樣 (4)電泳緩沖液沒調(diào)過ph，上次測了一下，1倍大概8.5， （5）樣品分子質(zhì)量越大，拖尾月嚴重。 （6）0.01m pb離子強度影響很大嗎 跪求高人解答 后面兩個是跑的血清樣品，濃縮膠5%，分離膠10%，其他條件基本和上面一直，手機拍的，不太清楚，拜托也給分析分析。 溶菌酶濃縮液.jpg 1.JPG 2.JPG |
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【答案】應助回帖
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Tris緩沖液的pH非常重要，否則條帶不sharp。調(diào)pH時加濃鹽酸接近所需pH，令其冷卻至室溫后再慢慢用1N鹽酸調(diào)。電泳液不必調(diào)pH，本身就是用的Tris-glycine緩沖體系。 膠在20分鐘內(nèi)凝可能有些快，一般是30-60分鐘凝為宜。凝膠速度過快會造成孔徑不均一。 為了減少電泳液漏的問題，可以在安裝電泳裝置時用1×的電泳液潤濕玻璃短板和所夾電極板。 如果你覺得樣品濃縮不好，可以適當加長濃縮膠，小膠大約1cm應該可以了。 感覺上樣量有點大。不是說不行，但想要很sharp的條帶，最好上樣量減半。順便問一下，你上樣前是否對樣品做了離心？ 磷酸緩沖液對跑SDS膠有點影響，但10mM問題不是很大。 |
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