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cwnboy2008金蟲 (小有名氣)
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[交流]
細(xì)胞裂解中DNA酶消化問題
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各位園友、前輩們： 我目前需要做一個(gè)胞質(zhì)蛋白的純化，1000mL的細(xì)胞懸液，密度大約在3.8*10E4/mL，準(zhǔn)備用Throme的RIPA來做裂解， 我們平時(shí)做pilot experiment 的時(shí)候都是用這個(gè)RIPA，并且按照protocol來操作，但是也會(huì)加入適量的PMSF(working Con.=1mM)來防止蛋白的降解，還會(huì)加入DNase I(amresco的粉末狀商品，自己用純水配置了DNase I的濃縮儲存液10mg/mL，工作濃度在20mg/L)來做DNA的消化，用來消除DNA帶來的粘稠問題。基本1mL的裂解體系，每次都能成功抽提到蛋白(前提是蛋白確實(shí)表達(dá)了)。 但是現(xiàn)在碰到的問題是裂解體系放大了很多，之前做過500mL的裂解體系，PMSF的量還是1mM，同時(shí)還加入了Roche的cocktail EDTA-free片劑來防止蛋白降解，還加了DNase I(working Con.=20mg/L)，還加入了RNase(working Con.=10mg/L)，但是幾次之間的裂解效果還是有差異，有的還是較為粘稠，離心完，離心管底部的膠片、果凍狀沉淀根本帖服不牢，稍微一晃動(dòng)就漂浮起來，沒法收集上清；而有的批次的裂解就較為澄清，離心后也較易收集上清，蛋白上柱純化效果也不錯(cuò)。 放大后裂解體系的操作步驟： 1. 500mL細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，棄上清； 2. PBS重懸細(xì)胞，離心，洗滌兩次（實(shí)驗(yàn)室用的全部是無血清培養(yǎng)基，如果不洗滌不知道是否會(huì)影響后面的PMSF、cocktail或者DNase I 的活性），棄上清； 3. 先用少量RIPA重懸細(xì)胞，同時(shí)加入PMSF和cocktail(提前用少量的PBS溶解)，用5mL的移液器或者移液管吹打，再添加至相應(yīng)的裂解體系(500mL)； 4. 至4度搖床上緩慢搖蕩，15min； 5. 觀察裂解效果，加入DNase I 和RNase，上下顛倒震蕩，并隨時(shí)觀察核酸的消化與裂解液粘稠情況； 6. 若上一步消化不明顯，則適當(dāng)延長消化時(shí)間，但限于置冰上操作； 7. 10500g，4度，離心，收集上清； 8. 純化步驟(略)。 (以上紅色加粗部分的操作是否恰當(dāng)，請指正) 疑問點(diǎn)： 1. RIPA本身裂解細(xì)胞的效果一直都還不錯(cuò)，就是核酸的存在影響太大，如何有其他高效的方法去除核酸的干擾； 2. throme公司的RIPA都是優(yōu)純級試劑，但不確定是否是EDTA-free的，如果有EDTA是否會(huì)影響DNase I的活性； 3. DNase I是否可以配置成水溶液，長期儲存，對活性有多大影響，本實(shí)驗(yàn)中是否是因?yàn)镈Nase I本省保存不當(dāng)而造成了活性下降； 4. DNase I的最佳活性是在37度，而我們?yōu)榱朔乐沟鞍捉到�，一直�?度操作，也是不是影響其活性的關(guān)鍵，如果必須使用，如何解決這個(gè)矛盾； 5. 有的網(wǎng)友在使用RIPA裂解細(xì)胞時(shí)，會(huì)特意添加EDTA來幫助消散細(xì)胞(當(dāng)然，這主要針對組織快裂解類型的實(shí)驗(yàn)，如果在裂解步驟引進(jìn)EDTA，后面如果銜接DNase I的消化問題) 6.DNase I的消化一般都建議添加Mg2+-free或者Ca2+-free來提高其活性，請問這種必要性有多大 問題可能有點(diǎn)多，有點(diǎn)羅嗦，都是為了讓您一次就能了解全部情況和問題所在，請諒解。謝謝您的參與與回答，謝謝。 |
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cwnboy2008
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2樓2012-10-25 21:31:52
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