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njutjhy銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR引物之NcoI的問題
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想做個PCR，在設(shè)計引物時遇到點問題。故在此發(fā)帖求助列位蟲友！ 目的基因：5’-CAG ……-3' 目標載體：PET-28a 我想在目的基因上游加Nco I 酶切序列（C/ CATGG），也需要酶切序列中的ATG作為起始密碼子。 但是后面多余了個G，會造成移碼突變的。結(jié)合各種信息，用這個酶及其中ATG的處理方法 1.如果目的基因是以G開頭的，那很好，直接使用�？上业牟皇牵� 2.可以在G之后根據(jù)引物的GC含量補充兩個密碼子。不知道這樣會不會對酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很大的影響？ 3.把后面的目的基因第一個密碼子改為G（譬如把CAG的改為GAG），但是這就是突變了，也應(yīng)該會對酶產(chǎn)生影響的吧！ 4.在CATGG后面隨便加上兩個密碼子之后再加個ATG，再接上目的基因。不知道這樣會對目的基因的表達產(chǎn)生什么影響？會不會導(dǎo)致表達量降低很多？ 歡迎各位蟲友表達針對以上各種方法闡述自己的意見，或者提出不同的建議！參與就有金幣拿！ 金幣不多，先懸賞100個吧！ [ Last edited by yqbter on 2012-11-2 at 10:22 ] |
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5樓2012-11-02 09:21:20
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！難道這次又沉了
？？？2樓2012-11-01 14:15:06
cicelyzh
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
njutjhy: 金幣+8, ★★★很有幫助 2012-11-02 16:55:28
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| 在pet28用Nco I 酶切位點，你是要把組氨酸標簽切掉嗎？樓主注意，如果你后續(xù)純化需要用到組氨酸標簽，那你就換個酶切位點。在C端的組氨酸標簽效果不是很好。一般蛋白質(zhì)加一個兩個氨基酸影響不是很大，在pet28上用BamH I和Hind I把酶加組氨酸標簽，會額外多好幾個氨基酸，影響都不是很大。防止Nco I 酶切位點的移碼突變，樓主就用你的自己提出的第1、2條就行了。 |
8樓2012-11-02 11:16:12
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9樓2012-11-02 17:05:42
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