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[求助]
與多糖相關(guān)的前輩們幫幫忙啊
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| 本人做多糖提取的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)提到了粗多糖，接下來該怎么辦呢？老師說讓先在薄層板上跑板，他說的什么意思��？ |
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9樓2013-04-11 13:52:51
小毛孩24
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2樓2012-11-05 22:46:52
dongle320
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
2320: 金幣+2, ★★★很有幫助, 謝謝您的幫助！ 2012-11-06 10:17:53
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2320: 金幣+2, ★★★很有幫助, 謝謝您的幫助！ 2012-11-06 10:17:53
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你只做了提取得到了一個(gè)混合物接下來要純化 1、脫蛋白和色素。 2、色譜柱純化 3、分子量測(cè)定 4、結(jié)構(gòu)確定 一、提取 樣品處理：洗凈，晾干、磨碎、過篩( 80 目) 1、熱水提法 料液比＝1∶（20-30）有報(bào)道1:30最好，90℃時(shí)浸提2h，反復(fù)浸提2次，5000r／min離心15min，殘?jiān)春笾貜?fù)離心一次，合并上清液，經(jīng)減壓濃縮(60℃)。 2、稀酸提法 在60-70℃用料液比1∶20、pH 2。0.17mol/L-HCl（pH＝2） 的稀鹽酸提取兩次，每次2h，離心，合并上清液用堿（NaOH）中和。 以上兩個(gè)方法可以輔助超聲波。輔助條件：物料比為1：30，提取時(shí)間為30min，溫度為60-70℃，pH為7．超聲波頻率以低頻好，高頻率會(huì)使多糖分子斷裂。 二、脫蛋白分離多糖 根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）為5∶1或4∶1（濾液:氯仿：正丁醇=25：（4、5）：1），混合物劇烈振搖20～30min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì).此種只能除去少量蛋白質(zhì)，效率不高，須反復(fù)多次，多糖有損失.但此方法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，用Sevage法效果更佳。Sevage 法和酶法聯(lián)用除蛋白即先添加0.1%的木瓜蛋白酶，在pH 6.5、50℃條件下酶解2h，再用Sevage 法反復(fù)脫蛋白6 次，直到中間層無沉淀產(chǎn)生為止，收集上層液，透析( 透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量3000u) 截留液減壓濃縮，加乙醇（3倍體積95%乙醇）至濃度為70%，靜置沉淀。生成沉淀經(jīng)丙酮、乙醚、無水乙醇依次洗滌（可除去色素），真空冷凍干燥得粗多糖。 注：除褐藻酸：取上述粗多糖溶解于蒸餾水中，加入終濃度為0.05mol /L 的CaCl2和20% 的乙醇，室溫放置過夜使沉淀完全， 3000r /min 離心20min，棄去粗多糖中的褐藻酸鈣沉淀。 三、純化 1、纖維素陰離子交換柱層析DEAE‐cellulose 最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或堿型），洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。 多糖溶液加入DEAE－52層析柱上端，分別用濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mol /L NaCl 溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0mL /min，以6mL /管進(jìn)行樣品收集。苯酚－硫酸法在480nm 處跟蹤檢測(cè)吸光度，繪制洗脫曲線，透析、濃縮、冷凍干燥，可以得到不同分子量的多糖。 2、凝膠柱層析 根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同進(jìn)行分離。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)及瓊脂糖凝膠(Sepharose)。多糖分離時(shí)多選用Sephadex G—50以分離相對(duì)分子量在1萬以下的各組分，然后選用Sephadex G-150-200進(jìn)一步純化。展層劑為各種濃度的鹽溶液及緩沖液，一般用0．1mol／L NaCl。 (20×430mm)，用苯酚—硫酸法進(jìn)行檢測(cè)，收集糖反應(yīng)陽性高峰部分，醇沉，干燥，即得純化的多糖。 要注意的是，對(duì)多糖的純化，其純度是相對(duì)的，不可能象某些成分那么單純。這里的純化僅是得到相對(duì)分子量在某一范圍里較為均一的多糖。 對(duì)于分子量較大的多糖，選擇的sephadexG類對(duì)應(yīng)的凝膠型號(hào)一般為sephadex G‐100、sephadex G‐150、sephadex G‐200，這些都屬于比較軟的一些凝膠（其中sephadex G‐200由于太軟已經(jīng)停止生產(chǎn)），這時(shí)，可以考慮用CellufineGCL‐2000代替，此填料的基材為纖維素，機(jī)械強(qiáng)度好，且它的分子量范圍較寬，比較適合多糖的分離。 實(shí)驗(yàn)流程： 濃縮液--離心--醇析--DEAE‐52 纖維素--Sephadex G‐200 凝膠層析--多糖含量的測(cè)定--多糖組分純度檢測(cè) |
3樓2012-11-06 00:31:13
【答案】應(yīng)助回帖
hsd3521: 應(yīng)助指數(shù)+1 2012-11-14 21:44:39
| 接下來要怎么做，主要還是要看你的實(shí)驗(yàn)是怎么設(shè)計(jì)的，如果你要做結(jié)構(gòu)表征，那么你就要像3樓的那樣，繼續(xù)過兩個(gè)柱子（一般是離子交換柱和凝膠柱），包括要透析、脫色、濃縮結(jié)晶什么的，從而得到高純度的多糖組分，此步較為繁瑣，制取周期長(zhǎng)，量也少。得到的所謂的多糖純品，還到底純度怎么樣？是需要實(shí)驗(yàn)證實(shí)的。那么接下來就是需要對(duì)多糖純度鑒定：最簡(jiǎn)單的方法就是去跑高效液相，當(dāng)然如果條件限制的話，你可以做聚丙烯酰胺電泳、薄層板、瓊脂糖電泳、氣相色譜也可以（需要衍生化）等等，純度鑒定為高純度純品之后，你就可以用你的純品做結(jié)構(gòu)表征了，主要包括：分子量分布情況、碳架結(jié)構(gòu)、單糖組分及比例、基團(tuán)等，這些你需要用到一些高技術(shù)儀器，譬如：高效液相、氣相、紫外、紅外、質(zhì)譜、原子吸收、核磁共振等等。主要是四大光譜的性質(zhì)。如果你能來很強(qiáng)的話，可以做這些，把多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)做個(gè)大概預(yù)測(cè)。如果你要做活性的話，那么有兩種情況：一是用粗糖去做，二是用精多糖來做（困難很大）。當(dāng)然也包括你是做體內(nèi)的還是體外的活性，也要看你實(shí)驗(yàn)是怎么設(shè)計(jì)的。如果以上你都做了，那就寫成英文的，你就直接發(fā)SCI吧。呵呵。祝你實(shí)驗(yàn)愉快啊。 |
4樓2012-11-14 15:59:06
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