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xiaoxiao70新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于雄性不育基因的克隆，目前卡在5’3‘端
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我在克隆一個(gè)雄性不育相關(guān)基因，中間片段已經(jīng)通過(guò)同源性設(shè)計(jì)的引物克隆得到，現(xiàn)在在用染色體步移的方法去克隆兩端，用的是寶生物的genome walking的試劑盒，每次二三次pcr出來(lái)的豐度不是很大，但是可以切膠回收得到。然后送去測(cè)序，總是沒(méi)有結(jié)果。 附測(cè)序公司的回信： 您的PCR樣品5’(2)，3’(2)（使用相對(duì)應(yīng)的引物）測(cè)序后發(fā)現(xiàn)有重疊現(xiàn)象,我們懷疑是由以下幾個(gè)方面的原因造成的： 1.已純化的PCR樣品造成這種情況的原因是由于模板純化有一定問(wèn)題，模板中含有非特異性的條帶； 2.如果是未純化的PCR產(chǎn)物，那么有可能是您要求測(cè)序的片段周?chē)写笮∠嘟臈l帶，我們通過(guò)瓊脂糖凝膠回收，無(wú)法有效切除這種大小差別不是很明顯的條帶； 3.模板或是引物質(zhì)量較差，測(cè)序反應(yīng)結(jié)束之后沒(méi)有產(chǎn)生足夠的目的產(chǎn)物，導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)較弱，雜背景較高，形成重疊現(xiàn)象。 這些原因都可能造成PCR樣品測(cè)序之后出現(xiàn)重疊現(xiàn)象.建議您改進(jìn)后重新進(jìn)行測(cè)序。 附圖是三次pcr 1%瓊脂糖凝膠電泳全部點(diǎn)樣后的圖。 5\' 123 2012-9-11.jpg 3\' 123 2012-9-19.jpg |
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