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jmren3361銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
熒光探針
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最近在學(xué)習(xí)熒光定量PCR，有幾個(gè)不懂的地方請(qǐng)教大家： TaqMan探針結(jié)合到模板上后，由于Taq酶的活性，被切割產(chǎn)生熒光 FRET、Molecular beacon、Scorpion primer結(jié)合到模板上后，是不是一直待在模板上？探針與模板的結(jié)合會(huì)不會(huì)影響PCR擴(kuò)增？探針與模板的結(jié)合與PCR擴(kuò)增是如何同步進(jìn)行的？ |
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zhang881007
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2樓2013-01-08 15:43:20
ccharlien
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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jmren3361: 金幣+1, ★★★很有幫助 2013-01-23 08:59:28
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jmren3361: 金幣+1, ★★★很有幫助 2013-01-23 08:59:28
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1. 探針不是一直待在模板上，在變性的時(shí)候也會(huì)解鏈，但由于探針的退火溫度高（一般設(shè)計(jì)的時(shí)候會(huì)比引物的退火溫度高10度以上），在引物還沒(méi)有退火結(jié)合到模板上的時(shí)候，探針已經(jīng)退火和模板結(jié)合了，因此探針和模板的結(jié)合程度高于引物。 2. 探針與模板的結(jié)合會(huì)不影響PCR擴(kuò)增，因?yàn)镻CR的時(shí)候已經(jīng)有較穩(wěn)定的探針-模板結(jié)合物 3. Taq酶的3'切割活性會(huì)在遇到探針-模板結(jié)合物的時(shí)候切割探針，使PCR繼續(xù)下去 |
3樓2013-01-08 20:11:06
jmren3361
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4樓2013-01-09 12:51:38
jmren3361
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5樓2013-01-09 12:52:30
hqsinberg
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6樓2013-01-09 13:04:45
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7樓2013-01-09 13:12:29
8樓2013-01-11 10:32:00
hqsinberg
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【答案】應(yīng)助回帖
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為了表達(dá)準(zhǔn)確我來(lái)個(gè)外文的原文（麻煩自己翻譯，以免別人的產(chǎn)生誤解，原版的外文分子生物學(xué)，絕對(duì)錯(cuò)不了。）SYBR® Green monitors the total amount of double-stranded DNA but cannot dis-tinguish between different sequences. To be sure that the correct target sequence is being amplified a sequence specific fluorescent probe is needed. An example is theTaqMan® probe (Applied Biosystems, Foster City, CA). The TaqMan® probe consistsof two fluorophores linked by a DNA sequence that will hybridize to the middle of the target DNA. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) transfers the energy from the short-wavelength fluorophore on one end to the long wavelength fluorophore at the other end. This quenches the short wave emission. During PCR the TaqMan® probe binds to the target sequence after the denaturation step that separates the two DNA strands. As the Taq polymerase extends the primer during the next PCR cycle it will eventually bump into the TaqMan® probe.The Taq poly-merase is not only capable of displacing strands ahead of it but also has a 5‘-nuclease activity that degrades the DNA strand of the probe.This breaks the linkage between the two fluorophores and disrupts the FRET. The short-wavelength fluorophore is now free from quenching and its fluorescence increases. In this case the increase in fluorescence is directly related to the amount of the specific target sequence that has been amplified。 |
9樓2013-01-11 12:43:00
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