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公司制備的短肽抗體小樣下周到手，一周內(nèi)要測(cè)試小樣情況，我需要做些什么準(zhǔn)備
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如題，去年十一期間選的序列讓制備了短肽抗體，三個(gè)半月過去了，剛公司技術(shù)上說下周ok，要送來小樣試用下，再?zèng)Q定是否送大樣。 有經(jīng)驗(yàn)的親們請(qǐng)幫忙給說說我都要做些什么準(zhǔn)備來試用小樣吧。 1.公司送小樣抗體時(shí)候郵寄的東西一般包括什么？二抗還要再買么，會(huì)附送有么？ 2.送來后怎樣進(jìn)行測(cè)試？需要電轉(zhuǎn)和wb，那是否要做抗體濃度梯度，還是直接用大濃度？ 3.怎樣才算測(cè)試合格？ |
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1，一般就是定制的抗體，二抗很普遍啊，一般實(shí)驗(yàn)室都會(huì)有，當(dāng)然你讓人家送，人家有，也應(yīng)該送，這個(gè)不值錢； 2，提您的目的蛋白，如果您的目的蛋白在野生型里，本身有表達(dá)，那么就不要再轉(zhuǎn)啦，直接體蛋白做WB，如果沒有表達(dá)，你之前的細(xì)胞裂解液沒留點(diǎn)么？不行就要再做瞬轉(zhuǎn)了； 3，WB是否出條帶，條帶是否是對(duì)的位置，雜帶多不多，是否影響觀察。 |
2樓2013-01-11 17:23:45
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 一般送小樣的時(shí)候還會(huì)給你pre-bleed。你需要做一個(gè)簡(jiǎn)單的western，用野生型或者你有過表達(dá)株的蛋白樣，最好能有knockout株作為負(fù)對(duì)照。分別用他給你的小樣和pre-bleed做一抗。不同稀釋比例當(dāng)然最好做，不過可以先用比較濃的，如1:1000, 如果有特異的帶在小樣prob的blot上而不在pre-bleed prob的blot上，分子量大小與目標(biāo)蛋白差不多的話就差不多可以確定了。確定抗體工作后再優(yōu)化稀釋比例，測(cè)定線性工作范圍。 |
3樓2013-01-12 07:41:33
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