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質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定
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質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定 把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術,送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質(zhì)粒是重組DNA技術中常用的載體。 質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中,它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì),如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,綞鑰股氐目剮緣取質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。 質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時,它也不能復制,通常每個細胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒分子,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復制和細胞分裂均受到抑制,緊密型質(zhì)粒復制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復制,質(zhì)粒拷貝數(shù)可由原來20多個擴增至1000-3000個,此時質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。 利用同一復制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中共同存在,當兩種質(zhì)粒同時導入同一細胞時,它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭,在一些細胞中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢,而在另一些細胞中另一種質(zhì)粒卻占上風。當細胞生長幾代后,占少數(shù)的質(zhì)粒將會丟失,因而在細胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種,這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細胞中。 質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產(chǎn)生某些抗生素,降解復雜有機物,產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。 質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間,如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。 從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時,細菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA,簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開,當外界條件恢復正常時,線狀染色體DNA片段難以復性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。 在細菌細胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中,除了超螺旋DNA外,還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。 第二節(jié) 材料、設備及試劑 一、材料 含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株,1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。 二、設備 微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 臺式高速離心機,恒溫振蕩搖床, 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋), 渦旋振蕩器, 電泳儀,瓊脂糖平板電泳裝置和 恒溫水浴鍋等。 三、試劑 LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g,NaCl 10 g,溶于800ml去離子水中,用NaOH調(diào)pH至7.5, 加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。 LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存?zhèn)溆谩? 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋),1％ SDS。 溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml,冰醋酸 11.5ml, H2O 28.5ml,定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。 RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。 飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA和DNA的交聯(lián),應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)緩沖液反復抽提使之飽和并使其pH值達到7.6以上,因為酸性條件下DNA會分配于有機相。 氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積＝1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性,操作時應戴手套。 TE緩沖液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。 STET：0.1 mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100。 STE：0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0)。 電泳所用試劑： （1） TBE 緩沖液 (5×)：稱取 Tris 54g,硼酸27.5g,并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至1000ml。 （2）上樣緩沖液 (6×)：0.25% 溴酚藍,40% (w/v) 蔗糖水溶液。 第三節(jié) 操作步驟 一、 細菌的培養(yǎng)和收集 將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。 二、 質(zhì)粒DNA少量快速提取 質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速,能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。 （一）、煮沸法 將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。 棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘,使液體流盡。 將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。 加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。 將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。 取20ml進行電泳檢查。 [注意] 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。 提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進一步實驗,如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應等。 （二）、 堿法 取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。 棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。 加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口,快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。 加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口,并倒置離心管,溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。 上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。 將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘。 棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。 吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。 將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0,含20μg /ml RNaseA)中,儲于-20℃冰箱中。 [注意] 提取過程應盡量保持低溫。 提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。 （三）、Wizard少量 DNA 純化系統(tǒng) Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA,整個過程只需15分鐘。提取的質(zhì)粒可直接用于DNA測序、酶切分析和體外轉錄等。 該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括10ml細胞懸浮液,10ml細胞裂解液；10ml中和液,50ml Wizard少量DNA純化樹脂,50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。 1-3ml過夜培養(yǎng)細胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。 去除上清液,菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。 加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數(shù)次,直到溶液變清亮。 加200μl 中和液,顛倒離心管數(shù)次。 4℃下12000g離心5分鐘,取上清液于新的eppendorf管中。 加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。 取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。 將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推,使柱洗液進入微型柱。 取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。 將微型柱放在一個新eppendorf管中,加50μl TE(或水)于微型柱中,靜止1分鐘后,4℃下12000g離心20秒。 丟棄微型柱,將eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。 [注意] 樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。 三、質(zhì)粒DNA的大量提取和純化 在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。 （一）、堿法 取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)液250ml,4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。 將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。 同步驟1方法離心以收集細菌細胞。 將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。 加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。 加9ml用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時應形成白色絮狀沉淀。 4℃下5000g離心15分鐘。 取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分鐘。 加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。 取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。 取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。 4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌,4℃下12000g離心5分鐘。 真空抽干沉淀,溶于500ml TE或水中。 [注意] 提取過程中應盡量保持低溫。 加入溶液II和溶液III后操作應混和,切忌劇烈振蕩。 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃ 1小時),使DNA酶失活。 （二）、Wazard大量DNA純化系統(tǒng) 堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統(tǒng)既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(200-20000bp)。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中,不含任何鹽份,可以直接用于DNA序列分析和酶切反應,也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液,150ml 細胞裂解液,150ml 中和液,100ml Wizard 大量DNA純化樹脂,125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支 Wizard帶有存儲離心管的柱子。 100-500ml細胞培養(yǎng)液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。 加15ml細胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鐘。 加15ml中和溶液,立即反復倒置離心管數(shù)次,并使之混勻。 14000g,22-25℃離心15分鐘。 小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。 加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。 棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。 加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 并渦旋混合。 每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega產(chǎn)品,與此配套)。 將樹脂/DNA混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。 將樹脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA進行洗脫(柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液),并加入柱子中。 真空抽干所加入的洗脫。 再加12ml柱子洗脫液進柱子并抽干。 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘。 取出柱子,真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘。 在柱子中加入1.5ml 65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5分鐘。 取出柱子,離心管中溶液即為提取的質(zhì)粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子,儲存在4℃或-20℃?zhèn)溆谩?br /> [注意] 在使用之前,系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。 純化樹脂必須混勻后再用。 （三）、Sephrose 2B柱純化質(zhì)粒DNA 堿法提取的質(zhì)粒DNA即使用RNA酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA制品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復性好,載體物質(zhì)可以再利用等優(yōu)點,因而已廣泛用于質(zhì)粒DNA純化。 將Sepharose 2B經(jīng)含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。 將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。 待DNA溶液完全進入柱內(nèi)后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)貯液瓶。 以1ml流出液為1份進行收集。 對每一管測定其OD260值,以確定哪些管中含有質(zhì)粒DNA。通常質(zhì)粒DNA在柱上流出的第一個峰中。 合并所有含質(zhì)粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉入新管。 加入2倍體積的冰冷無水乙醇,-20℃下沉淀10分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。 沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。 沉淀真空抽干,重新溶于TE或無 [注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現(xiàn)斷裂或氣泡現(xiàn)象,要使界面保持平整。對新裝成的柱,應用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內(nèi)的凝膠均勻。 |
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[考研] 0854電子信息求調(diào)劑 +7 | α____ 2026-03-22 | 9/450 |
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[考研] 一志愿南航材料專317分求調(diào)劑 +5 | 炸呀炸呀炸薯條 2026-03-23 | 5/250 |
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[考研]
 085404電子信息284分求調(diào)劑
+4
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13659058978 2026-03-24 | 4/200 |
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[考研] 333求調(diào)劑 +3 | ALULU4408 2026-03-23 | 3/150 |
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[考研] 接收2026碩士調(diào)劑(學碩+專碩) +4 | allen-yin 2026-03-23 | 6/300 |
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