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liurz

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3樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 08:34:07
感覺(jué)是酶切體系中質(zhì)粒用量太大。你的質(zhì)�？雌饋�(lái)濃度不錯(cuò)，20ul酶切體系里面你放了多少ug質(zhì)粒？

本人初次做這個(gè)，沒(méi)有DNA濃度測(cè)定儀器，根據(jù)MARKER大概估計(jì)的。

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11樓2013-01-25 14:28:49

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4樓: Originally posted by yesali at 2013-01-25 08:55:25
質(zhì)粒的量過(guò)多，適當(dāng)減少質(zhì)粒
另外酶切體系可適當(dāng)增大到40ul

不是質(zhì)粒，是線性基因，800bp左右，體系是50ul

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12樓2013-01-25 14:29:35

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6樓: Originally posted by l_dot at 2013-01-25 12:48:16
酶切體系為20ul，質(zhì)粒不要超過(guò)1微克
先測(cè)下質(zhì)粒濃度再加

沒(méi)有DNA濃度測(cè)定儀，實(shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃愣际歉鶕?jù)marder估計(jì)的

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13樓2013-01-25 14:30:28

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11樓: Originally posted by liurz at 2013-01-25 14:28:49
本人初次做這個(gè)，沒(méi)有DNA濃度測(cè)定儀器，根據(jù)MARKER大概估計(jì)的。...

那么根據(jù)marker也可以估計(jì)出來(lái)大致濃度。總之20ul體系里面的DNA最好不要超過(guò)1ug，絕對(duì)不要超過(guò)2ug，否則酶切很難完全。

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14樓2013-01-25 14:36:56

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
liurz: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-01-26 23:01:25

引用回帖:

7樓: Originally posted by liurz at 2013-01-25 13:34:35
抱歉，補(bǔ)充一下，酶切體是50ul，昨天寫錯(cuò)了。
酶切體系50ul，Xho I 和Not I各1ul（可以酶切2ug DNA），NEBbuffer 3加了5ul，純化后目的基因30ul（三PCR管一起純化得到），100×BSA 0.5ul，剩余無(wú)菌水補(bǔ)足50ul。37℃ ...

從膠上定量也需要你的帶與marker相應(yīng)的帶亮度差不多啊，你的這個(gè)用眼睛直接估計(jì)有些難度。按照你的估計(jì)700ng是上了多少ul？
雖然不知道你的PCR擴(kuò)增效率和回收效率，總之不一定要都切了吧。酶切后的一般是做連接，所需的DNA量是很少的，一般是低于100ng的。我認(rèn)為你切1ug是足夠的了。

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15樓2013-01-25 14:46:45

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14樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 14:36:56
那么根據(jù)marker也可以估計(jì)出來(lái)大致濃度。總之20ul體系里面的DNA最好不要超過(guò)1ug，絕對(duì)不要超過(guò)2ug，否則酶切很難完全。...

我也知道，關(guān)鍵是估計(jì)濃度本人沒(méi)經(jīng)驗(yàn)，所以加的量也就不準(zhǔn)了。
另外，我的體系是50ul.

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16樓2013-01-25 16:10:06

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15樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 14:46:45
從膠上定量也需要你的帶與marker相應(yīng)的帶亮度差不多啊，你的這個(gè)用眼睛直接估計(jì)有些難度。按照你的估計(jì)700ng是上了多少ul？
雖然不知道你的PCR擴(kuò)增效率和回收效率，總之不一定要都切了吧。酶切后的一般是做連接， ...

我準(zhǔn)備下次稀釋5倍上樣，盡量使亮度相當(dāng)，這樣才好估計(jì)。
第一次做這些實(shí)驗(yàn)，總感覺(jué)目的基因與質(zhì)粒的比例越大越好，所以就盡量多切些目的基因。另外對(duì)濃度估計(jì)也不準(zhǔn)，所以結(jié)果就這樣了。

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17樓2013-01-25 16:13:39

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即使沒(méi)有酶切完全，也不應(yīng)該條帶比原來(lái)還大吧，也應(yīng)該位置一樣啊，我只是酶切下來(lái)10個(gè)堿基左右，也不應(yīng)該拖尾啊。
還有人說(shuō)我的酶和目的基因結(jié)合造成的拖尾，不知什么原因哪。

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18樓2013-01-25 16:21:09

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

同意2樓說(shuō)法，酶切貌似不完全，不過(guò)你酶量加的很多了，不知多少濃度的酶，按照NEB官網(wǎng)，你的酶量已經(jīng)在20U左右了。還是再嘗試延長(zhǎng)酶切時(shí)間吧。弱弱的問(wèn)下，你雙酶切后沒(méi)小片段，雙酶離得很近？

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19樓2013-01-25 18:48:21

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沒(méi)看第二頁(yè)不好意思。。。。

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20樓2013-01-25 18:49:29

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